Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Christian Sch&#252;tz; Martin Fleck; Jonathan P. Schneck; Mathias Oelke

doi:10.3791/51859

JoVE Journal > Immunology and Infection

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

면역학 및 감염병학

القاتل مستضد تقديم الخلايا الاصطناعي (KaAPC) للكفاءة في المختبر استنفاد خلايا T الإنسان مستضد محددة

Published: August 11, 2014

doi:

10.3791/51859

Christian Schütz¹, Martin Fleck^2,3, Jonathan P. Schneck¹, Mathias Oelke¹

¹Department of Pathology, Institute of Cell Engineering,Johns Hopkins University, ²Department of Internal Medicine I,University of Regensburg, ³Department of Rheumatology,Asklepios Medical Center

Summary

يتم عرض المبادئ التوجيهية لتوليد القاتل الاصطناعي مستضد تقديم الخلايا، KaAPC، أداة فعالة لنضوب في المختبر من خلايا T مستضد معين الإنسان وحل بديل لالمناعي الخلوي لعلاج T-الخلية بوساطة أمراض المناعة الذاتية في antigen- الأزياء محدد دون المساس الجهاز المناعي المتبقية.

Abstract

العلاج الحالي من الخلايا T بوساطة أمراض المناعة الذاتية وتعتمد في الغالب على استراتيجيات المناعة العالمي، والتي، على المدى الطويل، مصحوبا الآثار الجانبية السلبية مثل انخفاض القدرة على التحكم الالتهابات أو الأورام الخبيثة. لذا، لا بد من وضع تستهدف فقط الخلايا المرض التوسط وترك الجهاز المناعي ثبات نهج جديدة. على مدى العقد الماضي مجموعة متنوعة من استراتيجيات العلاج المناعي الخلايا استنادا إلى تعدل وقد وضعت T خلية بوساطة الاستجابات المناعية. معظم هذه الطرق تعتمد على مستضد تقديم الخلايا يحفز التسامح (APC). ومع ذلك، بالإضافة إلى كونها صعبة ومرهقة من الناحية الفنية، هذه النهج القائم على خلية حساسة للغاية لالسامة للخلايا T استجابات الخلايا، مما يحد من قدرتها العلاجية. هنا نقدم بروتوكول لتوليد خلايا مستضد تقديم الاصطناعي القاتل غير الخلوية (KaAPC)، والذي يسمح للنضوب خلايا T مرضية مع ترك اعادةاملتبقي جهاز المناعة يمسها والوظيفية. KaAPC هو الحل البديل لالمناعي الخلوي التي لديها امكانات لعلاج أمراض المناعة الذاتية والرفض طعم خيفي من خلال تنظيم غير مرغوب فيها استجابات الخلايا التائية بطريقة محددة مستضد.

Introduction

على مدى العقدين الماضيين تم إحراز تقدم كبير في فهم الآليات المسببة للأمراض من أمراض المناعة الذاتية. ومع ذلك، فإن العلاج الأكثر شيوعا لا تزال تعتمد على الستيرويدات القشرية وكذلك الأدوية المثبطة للمناعة مثل البيورين النظير، وكلاء مؤلكل ومثبطات الكالسينيورين ^1. استخدام مثل هذه العقاقير قد تحسنت كثيرا في تشخيص المرضى، إلا أن العلاج لا يقدم علاجا لخلل مناعي الأساسي. وعلاوة على ذلك، والمرضى تصبح عرضة للالتهابات وإلى تطور السرطان.

بالتالي الهدف النهائي للعلاج من الخلايا T بوساطة أمراض المناعة الذاتية ورفض طعم خيفي هو خصيصا لاستهداف المرض الوحيد تسبب خلايا T بينما، في الوقت نفسه، وترك الجهاز المناعي المتبقية يمسها والمختصة لمكافحة الاضطرابات المناعية. استخدام الخلايا المقدمة للمستضد (APC) كعلاج لقمع الطرفية استجابات الخلايا T وصفت لأول مرة في اقرب وقتفي 1970s من قبل عدة مجموعات. منذ ذلك الحين تم تطوير الكثير من النهج القائم على الخلية (التي استعرضت في شوتس وآخرون. ^2). باستخدام استراتيجيات، معربا عن FASL القاتل-APC كما أظهرت خلايا immunoregulatory نتائج واعدة مشيرا إلى الإمكانات العلاجية لعلاج المناعة الذاتية، ورفض المزروع والالتهابات المزمنة. ومع ذلك، هناك قيود كبيرة مع استخدام استراتيجيات FASL القاتل-APC التي حدت في نهاية المطاف تطبيق سريري لها؛ (ط) جيل أو عزل APC هو الوقت والعمل ومكثفة التكلفة (ب) من المرضى الذين يعانون من قلة الكريات بسبب كبت المناعة توفر كميات محدودة ونوعية الخلايا (الثالث) الطلاء أو تنبيغ APC مع موت الخلايا المبرمج الذي يحفز إشارات مثل نتائج في غاية FASL الظواهر المتغيرة و (iv) القاتل APC-حساسة للالسامة للخلايا وظائف المستجيب للخلايا T بالتالي الحد من قدرتها العلاجية. وبالتالي، فمن الصعب ضمان استنساخه القاتل APC-pheno محددةنوع التي يمكن استخدامها لتعديل مستضد معين من استجابات الخلايا T في الجسم الحي.

على أساس عملنا السابق مع FASL معربا عن القاتل-APC ^3-5 والخلايا المقدمة للمستضد الاصطناعية (AAPC) ^6،7 قمنا بتطوير النهج القائم على حبة (KaAPC) لتثبيط مستضد معين أو القضاء على خلايا T لصناعة السيارات في رد الفعل المختبر. تتكون KaAPC من ديمر HLA-A2 مكتب المفتش العام (إشارة 1) ومكافحة فاس ماب (موت الخلايا المبرمج الذي يحفز إشارة) يجمد تساهميا على سطح من 4.5 ميكرون لاتكس ممغطس حبة. أنها تستنفد خلايا T مستضد معين بطريقة بوساطة فاس / FASL من مزارع الخلايا T من خصوصيات متعددة بطريقة مستضد محددة ومستقلة عن تفعيل يسببها موت الخلايا (AICD) المسار. هو فعل جرعة موت الخلايا المبرمج في الخلايا T تعتمد المستهدفة بسرعة بالفعل بعد 30 دقيقة ^8.

KaAPC يمكن أن تتولد بسهولة بطريقة تسيطر عليها ضمان محددة قبالة phenot الرف[يب] والتغلب على معظم أوجه القصور في الاستراتيجيات القائمة على الخلايا استنزاف. بالتالي، KaAPC عرض إمكانات كبيرة لعلاج الخلايا T بوساطة أمراض المناعة الذاتية ورفض طعم خيفي، المضي قدما في مجال استراتيجيات العلاج المحددة T الخلية.

Protocol

1. الجيل من HLA-A2 مكتب المفتش العام وبناء KaAPC إعداد العازلة بورات العقيمة. جعل 0.1 M الحل من حمض البوريك في الماء وضبط درجة الحموضة إلى 7.0. تصفية العقيمة (0.22 ميكرون) العازلة وتخزينها في 4 درجة مئوية. إعداد عقيمة غسل العازلة حبة. استخدام الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) بدون المغنيسيوم والكالسيوم. إضافة البشرية AB المصل لمدة 3٪ تركيز النهائي. إضافة حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA) لمدة 2 ملي التركيز النهائي. إضافة أزيد الصوديوم (نان 3) ل0.01٪ تركيز النهائي. تصفية العقيمة (0.22 ميكرون) العازلة وتخزينها في 4 درجة مئوية. نقل 250 ميكرولتر من الخرز الايبوكسي (حوالي 100 × 10 6 حبات) من الأوراق المالية إلى العقيمة، رأس المسمار قارورة زجاجية. إضافة 250 ميكرولتر من العازلة بورات. وضع قنينة زجاجية على المغناطيس والسماح حبات تلتزم لمدة 2 دقيقة. نضح العازلة وإزالة الزجاج قنينة من المغناطيس. تغسل حبات مرة واحدة مع 1 مل العازلة بورات. Resuspend الخرز في 550 ميكرولتر من 0.018 ميكروغرام/ مل HLA-A2 مكتب المفتش العام و 3.64 ميكروغرام / مل المضادة للبشرية CD95 ماب (استنساخ CH11) وتخلط بلطف عن طريق هز. (يرجى الاطلاع على قسم المناقشة للحصول على معلومات إضافية.) احتضان قارورة زجاجية على نهاية محور دوار على النهاية، في 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. تدور باستمرار الخرز في 300 x ج لمدة 2 دقيقة. وضع قنينة زجاجية على مغناطيس لمدة 2 دقيقة ونضح "KaAPC حل تحميل". إزالة الزجاج قنينة من المغناطيس، إضافة 1 مل من حبة غسل العازلة و resuspend بعناية من قبل تهتز. كرر الخطوة 1.10 مرتين. احتضان قارورة زجاجية على محور دوار عند 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في 1 مل غسل العازلة حبة. عند هذه النقطة، سيتم حظر جميع المواقع المتبقية البروتين ملزمة البشري المصل AB الواردة في غسل العازلة حبة. تدور باستمرار الخرز في 300 x ج لمدة 2 دقيقة. مكان زجاج القارورة على مغناطيس لمدة 2 دقيقة وعازلة نضح غسل حبة. إزالة الزجاج قنينة من المغناطيس واستبدال الحل مع 1 مل من برنامج تلفزيوني. 2. مراقبة الجودة، الببتيد تحميل، Wالترميد والتخزين، واستقرار KaAPC نقل 1.5 × 10 5 KaAPC في أنبوب FACS وتغسل مع 1 مل FACS غسل العازلة. الخرز resuspend في 100 ميكرولتر FACS غسل العازلة وإضافة 1 ميكرولتر من مكافحة فأر IgG1 PE (للكشف عن الجزء التيسير من HLA-A2 مكتب المفتش العام) و 1 ميكرولتر من مكافحة فأر الغلوبولين المناعي FITC (استنساخ R6-60.2، للكشف من ماب CD95 مكافحة الإنسان). احتضان لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية، وتغسل مع 1 مل FACS غسل العازلة، وresuspend في 250 ميكرولتر FACS غسل العازلة وقراءة تلطيخ التدفق الخلوي. وقد تم تنفيذ الشكل 1. صمة عار QC دفعة KaAPC التي كما جاء في القسم بروتوكول تلطيخ كما هو موضح في قسم البروتوكول تم الكشف 2. HLA-A2-الإيج باستخدام الماوس مكافحة IgG1 PE MAB، بينما الإنسان ومكافحة CD95 تم الكشف عن (مكافحة فاس) مع المضادة للماوس-الغلوبولين المناعي FITC ماب (انظر بروتوكول حد ذاتهction 2.2) (الخط الأزرق). وتمثل الرسوم البيانية شغل الخرز فارغة سوداء ملطخة مكافحة فأر IgG1-PE ماب أو مكافحة فأر-الغلوبولين المناعي FITC MAB، على التوالي. أرقام في الزاوية اليمنى العليا تشير إلى شدة الفلورسنت متوسط (MFI). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. لنقل الببتيد تحميل 20 × 10 6 KaAPC في قارورة زجاجية معقمة جديدة، ضع على مغناطيس لمدة 2 دقيقة، نضح PBS و resuspend الخرز في 500 ميكرولتر برنامج تلفزيوني جديد مع 5 ميكروغرام الببتيد (نضع في اعتبارنا، سوف الببتيدات فقط HLA-A2 مقيدة ربط على ديمر!). مخزن تحميل KaAPC في 4 درجات مئوية حتى استخدامها، لمدة 3 أيام على الأقل للسماح كافية تحميل الببتيد على ديمر HLA-A2 مكتب المفتش العام. مباشرة قبل الاستخدام، وغسل الببتيد تحميل KaAPC كما هو مبين في 1.14. كرر هذه الخطوة على الأقل 6X. ملاحظة: هذا هو خطوة حاسمة لضمان الببتيد الحر لديه رس تتم إزالتها بالكامل لتجنب قتل كاذبة النتائج الإيجابية؛ وقد تبين الببتيد الحرة المتبقية للحث على موت الخلايا المبرمج في مستضد محددة الثقافات الخلايا T 9. استبعاد تأثير الببتيد القابلة للذوبان، تشغيل عينات السيطرة طاف من الببتيد تحميل وغسلها KaAPC (انظر 3.8). عد الخرز باستخدام عدادة الكريات وتسمية مع التاريخ واسم الببتيد والتركيز. ملاحظة: محملة KaAPC تبقى ظيفية في 4 درجة مئوية لمدة شهر واحد على الأقل. بعد شهر واحد، وإعادة التحميل مع نفس الببتيد KaAPC يسمح لاستخدامها لمدة تصل إلى سنة واحدة. 3. KaAPC في المختبر قتل الفحص إعداد وسائل الاعلام المشارك الثقافة. إعداد الكامل المتوسطة RPMI تستكمل مع 3٪ T عامل نمو الخلايا (صنع في المختبر 6) و 3٪ المانحة البلازما ذاتي. إذا المانحة البلازما الذاتي غير متوفر، استخدام الحرارة المعطل AB المصل البشري. إعداد AnnexinV ملزمة إعداد العازلة. حل 8.12 غرام كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) و 0.12 جم أحسبكلوريد البوتاسيوم (CaCl 2) في 990 مل DDH 2 O.Add 10 مل 1M HEPES العازلة. توليد خلايا T مستضد محددة الإنسان. (للحصول على بروتوكول مفصلة يرجى الاطلاع على نشرة السابق 7 الاصطناعية باستخدام مستضد تقديم الخلايا (AAPC)). ضمان خصوصية الببتيد هي على الأقل> 75٪ على النحو الذي يحدده تلطيخ tetramer. لكل عينة احتضان 2 × 10 5 خلايا T مستضد محدد / جيد (في 96 جولة جيدا أسفل اللوحة) في 200 ميكرولتر من شارك في مستنبت في نسبة 1: 1 مع KaAPC لمدة 48 ساعة في حاضنة ترطيب عند 37 درجة C و 5٪ CO 2. عينات الحصاد ونقل في أنبوب FACS. تغسل مع 1 مل AnnexinV العازلة ملزمة، تدور باستمرار في 300 x ج لمدة 5 دقائق، وتجاهل طاف resuspend في 100 ميكرولتر من العازلة ملزمة AnnexinV عينات وصمة عار مع 1 ميكرولتر AnnexinV FITC و 5 ميكرولتر 7-AAD لمدة 10-15 دقيقة في RT، ويغسل مع 1 مل AnnexinV العازلة ملزمة. تدور باستمرار في 300 x ج لمدة 5 دقائق، وتجاهل طافد resuspend في 250 ميكرولتر العازلة ملزمة AnnexinV قراءة عينات فورا على تدفق عداد الكريات. تحضير العينات التالية لتحديد قتل مستضد معين عن طريق KaAPC: خلايا T فقط؛ خلايا T + ذوبان مكافحة CD95. خلايا T + تفريغ KaAPC. خلايا T + الببتيد غير تحميل KaAPC وما شابه ذلك. خلايا T + الببتيد تحميل KaAPC وما شابه ذلك. الخلايا التائية + طاف من الببتيد تحميل KaAPC وما شابه ذلك. . الشكل 2. KaAPC قتل مقايسة الببتيد تحميل KaAPC او الخرز التحكم (HLA-A2-الإيج حبات فقط) تم تربيتها لمدة 48 ساعة عند نسبة 1: 1 مع CMVpp65 خلايا T معينة (~ 80٪)، حصادها والملون لاحقا مع AnnexinV ويوديد propidium (PI) لتحديد الخلايا التي التدفق الخلوي (انظر القسم بروتوكول 3،3-3،7). "وما شابه ذلك" يشير إلى حبات محملة CMVpp65 و "غير المشابهة" ليكونإعلانات محملة مارت-1 الببتيد. الأرقام تشير إلى النسبة المئوية للخلايا T قابلة للحياة في الربع السفلي الأيسر من كل مؤامرة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. لأداء تتقاطع-التجارب، توليد خلايا T مستضد معين من اثنين من خصوصيات مختلفة. وعلاوة على ذلك تقييم مستضد معين من استنزاف قدراتهم في KaAPC مع تحليل المتزامن للقضاء مستضد معين من خلايا T في غير متجانسة السكان الخلية T. (للحصول على بروتوكول مفصلة يرجى الاطلاع شوتس وآخرون 10).

Representative Results

ملامح هذا البروتوكول تشمل جيل متميز من النمط الظاهري KaAPC التي تعرض HLA-A2 مكتب المفتش العام (إشارة 1) ومكافحة فاس ماب (إشارة موت الخلايا المبرمج) في نفس الوقت، والتي بالمقارنة مع النهج القائمة على الخلية لا يتغير عن طريق طلاء أو كفاءات التنبيغ ويمكن التضمين بسهولة أثناء الإنتاج (الشكل 1). وعلاوة على ذلك، KaAPC، ليست حساسة إلى وظائف المستجيب السامة للخلايا T والخلايا وظائفها لا يعتمد على نوعية الخلايا المقدمة للمستضد ذاتي قبل وبعد التلاعب في المختبر. KaAPC قادرة على استنفاد خلايا T مستضد محددة في المختبر عندما محملة الببتيد وما شابه ذلك، في حين أن غير المشابهة محملة سوف KaAPC لا تستنفد خلايا T (الشكل 2). ولذلك، KaAPC لحث الخلايا التائية الخلايا بطريقة مستضد معين. بعد ذلك، كنا KaAPC لاستنزاف الانتقائي للخلايا T مستضد معين من خليط من مختلف جمعية مهندسي البترول الخلايا التائيةcificities، مما يدل على أنه ليس هناك سوى الحد الأدنى من السمية الخلوية ويتسرب إلى الجار T الخلايا (الشكل 3). وبالتالي، KaAPC تمثل أداة رائعة لفي المختبر مستضد معين نضوب خلايا T مستضد محددة البشرية تفعيلها مع تطبيق السريرية المحتملة لعلاج أمراض المناعة الذاتية والرفض طعم خيفي.

Discussion

الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول هي ضمان نسبة مناسبة من إشارة 1 (الببتيد MHC) وإشارة 2 (مكافحة فاس MAB). وقد أجرينا تجارب المعايرة مكثفة لتحديد النسبة المثالية للإشارة 1 و 2؛ أصبح واضحا أن اختلافات طفيفة بسبب الاختلافات في ديمر HLA-A2 الإيج أو تركيزات مضادات فاس ماب يمكن أن تتداخل مع وظائف KaAPC. وبالتالي، ينبغي دائما التحقق من تركيز كل من إشارات، وينبغي في كثير من الأحيان يتم اختبار جودة كل من البروتينات حتى لو كان أمر بذلك من مصدر تجاري. وعلاوة على ذلك، ينبغي دائما أن تحدد التركيزات من قبل نفس الفحص وفحوصات الكشف مختلفة قد يؤدي إلى تركيزات مختلفة. ويمكن أيضا ظائف HLA-A2-الإيج تنخفض قيمتها بسبب refolding ناقصة و / أو غير فعالة الببتيد تحميل. وعلاوة على ذلك يمكن تجميع الجزيئات ديمر بدرجات مختلفة، والتي يمكن أن تؤثر على النشاط الوظيفي للبروتين. ولذلك، فإن ACTUكمية من آل ديمر حاجة للجيل من KaAPC ظيفية ومحددة قد تختلف. بالإضافة إلى ذلك، وجدنا أن مجموعة مثالية للموت حمل إشارة مكافحة فاس ماب على KaAPC هو ضيق للغاية. في أيدينا كميات أكبر 3.64 ميكروغرام / مل تؤدي إلى القتل غير محدد من فاس خلايا T إيجابي في حين أدت كميات أقل من 3.64 ميكروغرام / مل في انخفاض النشاط القتل، حسب الجرعة. في حين أن هذه الشروط تبدو ضيقة جدا، والانتباه إلى هذه التفاصيل يؤدي إلى جيل من KaAPC ظيفية ومحددة.

في حين أن النمط الظاهري KaAPC الحالي وظيفية لاستنفاد خلايا T مستضد معين تفعيلها، التجارب الأولية التي تستهدف خلايا T مستضد معين ساذجة أو يستريح أظهر أي تحريض كبير من الخلايا مستضد معين كما خفضت هؤلاء السكان فاس التعبير. وبالتالي، يمكن للمرء أن يتصور مضيفا إشارة شارك في تنشيطية على KaAPC للحث على تنظيم ما يصل من فاس على يستريح خلايا T لجعل تحويلها إلى هدف لKaAPC. في حين أن هذا أمر ممكن كل ثلاث إشارات سيتعين معاير بعناية لضمان KaAPC النمط الظاهري وظيفية.

ضبط منصة حبة لمصفوفة قابلة للتحلل حيويا أو تعزيز وتطبيق KaAPC في الجسم الحي. مؤخرا، شن آخرون قد ذكرت ناجحة في استخدام الجسم الحي من KaAPC استخدام الخرز 5 ميكرون لاتكس مترافق لمكافحة فاس (استنساخ Jo2) ومكافحة صاحب / H2-K ^ب -TRP2 ^11. لقد كنا قادرين على إظهار أن المفهوم العام من الخلايا المقدمة للمستضد الاصطناعية (AAPC) يمكن نقلها بنجاح من ميكرون الحجم لجزيئات بحجم نانومتر ¹² و يتأثر هذه الوظيفة بواسطة الجسيمات الهندسة ^13. وهكذا، من خلال تغيير حجم و / أو شكل KaAPC المستقبل تصاميم واحدة قد تكون قادرة على التأثير على وظيفة في الجسم الحي وتوزيع الحيوي، والذي يمكن أن يكون المفتاح لنجاح العلاج من أمراض المناعة الذاتية الخاصة بالأعضاء.

KaAPC تغلب على أوجه القصور الرئيسية لاستراتيجيات استنزاف خلية مقرها باعتبارها سهلة الاستخدام "من على الرف" والوقت ونهج فعالة من حيث التكلفة تعمل بشكل مستقل عن حالة المانحة وما قبل المعالجة. KaAPC ليست أهداف الذاتي أو نظير الصماوي إشارات القتل ويست حساسة إلى وظائف المستجيب لحل الخلايا من CTL. سوف KaAPC تتطلب التعرف على المستضد مرض ذات الصلة والتي تعتمد على نوع HLA معين. في حين أن العديد من المستضدات حاليا مناسبة HLA-A2 مقيدة لمرض السكري نوع 1، وقد تم تحديد GvHD ومضاعفات التصلب ^2، وتطوير الطبقة HLA إضافية I ديمر الجزيئات فضلا عن تحديد المستمر للمستضدات ذات الصلة المناعة الذاتية الجديدة زيادة وتوسيع انطباق KaAPC. وعلاوة على ذلك يمكن للمرء التفكير في استخدام KaAPC التي تستهدف الحواتم مختلفة لاستهداف مستضدات متعددة في نفس الوقت.

باختصار، KaAPC تمثل تكنولوجيا منصة مرنة لفريق tigen محددة استنزاف الخلايا التائية. تمكن طبيعتها "مثل ليغو" إدراج إشارات جديدة مثل إشارات المشارك المحفزة أو المثبطة إضافية مثل PD1 أو TRAIL على مختلف المصفوفات التي يمكن توسيع وتعزيز اللاحقة في التجارب المختبرية وتطبيق الجسم الحي. هنا نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لتوليد KaAPC، ونهج حبة الأولى استنادا للقضاء على خلايا T مستضد معين من الخلايا T مخاليط مع خصوصيات مختلفة.

الرقم 3. KaAPC القضاء على CTL بطريقة محددة مستضد PKH26 المسمى تنشيط فاس ⁺ CTL المستجيب الذاكرة وPKH67 المسمى CTL CMVpp65 محددة من نفس الجهات المانحة كانت مختلطة إلى 1: نسبة 1 وشارك في تربيتها مع ^CMVpp65 KaAPC لمدة 48 ساعة. وعولج الثقافات التحكم مع ^تفريغ KaAPC، أو 1 ميكروغرام / ملمن ذوبان مكافحة فاس-ماب (استنساخ CH11). تم تحديد فقدان الحد الادنى من خلايا قابلة للحياة في غير المعالجة CTL الثقافات المختلطة (T _{المزيج).} وأظهرت بيانات نظام مراقبة الأصول الميدانية الأصلية لكل السكان CTL من _مزيج T. تم إجراء تحليل الخلايا كما نشرت سابقا النابضة منفصل على كل السكان الخلية T ^10. أرقام صورت في الأرباع اليسرى العليا تمثل٪ من مجموع الخلايا. ويستمد هذا الرقم يوضح من تجربة تمثيلية واحدة من ثلاث تجارب مستقلة. وقد نشر هذا البحث في الأصل في الدم. . شوتس، C. وآخرون القاتل الخلايا المقدمة للمستضد الاصطناعية: استراتيجية جديدة لحذف خلايا T معينة الدم. 2008؛ 111، 3546-52. جميع الحقوق محفوظة للجمعية الأمريكية لأمراض الدم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الألمانية للبحوث (DFG) SCHU-2681 / 1-1 (CS) وKFO 146 (MF)، وزارة الدفاع وزارة الدفاع من PC منحة 040972 (MO) والمعهد الوطني للصحة منح RO1 CA108835 ، RO1 Ai44129 (JPS)

Materials

Name	Company	Cat #	Comments
PBS	Corning	21-040-CV
human AB serum	Atlanta biologicals	S40110
EDTA	Sigma/Aldrich	E5134
sodium azide	Sigma/Aldrich	71289
M-450 epoxybeads	Invitrogen/Dynal	14011
MPC-1 magnet	Invitrogen/Dynal	12001D
screw top glass vial	Fisher Scientific	03-338AA
MACSmix Tube Rotator	Miltenyi	130-090-753
anti-CD95 (clone CH11)	Milliore	05-201
HLA-A2-Ig dimer	BD/Pharmingen	551263
Cryo-tube 2ml	Corning	430488
anti-mouse IgG1 PE	BD/Pharmingen	559320
anti-mouse IgM FITC	BD/Pharmingen	553408
sodium chloride	Merck	S271-3
calcium chloride	Sigma/Aldrich	C5080
HEPES	cellgro/Mediatech	25-060-CI
RPMI	gibco/life technologies	11875-085
96well round bottom plate	Falcon	353077
AnnexinV FITC	PromoKine	PK-CA577-1001-1000
7-AAD	BD/Pharmingen	51-68981E
FACS tubes	Falcon	352008

References

Bizzaro, N., Tozzoli, R., Shoenfeld, Y. Are we at a stage to predict autoimmune rheumatic diseases. Arthritis and rheumatism. 56 (6), 1736-1744 (2007).
Schütz, C., Oelke, M., Schneck, J. P., Mackensen, A., Killer Fleck, M. artificial antigen-presenting cells: the synthetic embodiment of a “guided missile. Immunotherapy. 2 (4), 539-550 (2010).
Hoves, S., et al. Mature but not immature Fas ligand (CD95L)-transduced human monocyte-derived dendritic cells are protected from Fas-mediated apoptosis and can be used as killer APC. Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 170 (11), 5406-5413 (2003).
Hoves, S., et al. Elimination of activated but not resting primary human CD4+ and CD8+ T cells by Fas ligand (FasL/CD95L)-expressing Killer-dendritic cells. Immunobiology. 208 (5), 463-475 (2004).
Schütz, C., Hoves, S., Halbritter, D., Zhang, H. -. G., Mountz, J. D., Fleck, M. Alloantigen specific deletion of primary human T cells by Fas ligand (CD95L)-transduced monocyte-derived killer-dendritic cells. Immunology. 133 (1), 115-122 (2011).
Oelke, M., Maus, M. V., Didiano, D., June, C. H., Mackensen, A., Schneck, J. P. Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells. Nature. 9 (5), 619-624 (2003).
Chiu, Y. -. L., Schneck, J. P., Oelke, M. HLA-Ig based artificial antigen presenting cells for efficient ex vivo expansion of human CTL. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (50), (2011).
Schütz, C., et al. Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells. Blood. 111 (7), 3546-3552 (2008).
Snow, A. L., Pandiyan, P., Zheng, L., Krummey, S. M., Lenardo, M. J. The power and the promise of restimulation-induced cell death in human immune diseases. Immunological reviews. 236 (1), 68-82 (2010).
Schütz, C., et al. A new flow cytometric assay for the simultaneous analysis of antigen-specific elimination of T cells in heterogeneous T cell populations. Journal of immunological. 344 (2), 98-108 (2009).
Shen, C., et al. artificial antigen-presenting cells deplete alloantigen-specific T cells in a murine model of alloskin transplantation. Immunology letters. 138 (2), 144-155 (2011).
Perica, K., et al. Nanoscale artificial antigen presenting Cells for T cell immunotherapy. Nanomedicine nanotechnology, biology, and medicine. 10 (1), 119-129 (2013).
Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells. Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2013).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Schütz, C., Fleck, M., Schneck, J. P., Oelke, M. Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells. J. Vis. Exp. (90), e51859, doi:10.3791/51859 (2014).