JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
신경과학

Eenzijdige Pyramidotomy van de corticospinale Tract bij ratten voor de Beoordeling van neuroplasticiteits inducerende therapieën

Published: December 15, 2014
doi:
10.3791/51843
, , , , ,
1Neurorestoration, Wolfson Centre for Age-Related Diseases,King’s College London, 2Department of Neuroscience,Baylor College of Medicine

Summary

Het corticospinale kanaal, een van de belangrijkste sensorimotorische stukken kunnen eenzijdig worden laesie bij knaagdieren hersenstam om neuroplasticiteits inducerende therapieën testen het centrale zenuwstelsel. Deze chirurgische procedure ("pyramidotomy") en postoperatieve evaluaties worden beschreven in dit protocol.

Abstract

De corticospinal darmkanaal (CST) kan volledig eenzijdig worden verbroken in het medullaire piramiden van het knaagdier hersenstam. De CST is een motor darmkanaal groot belang voor distale spiercontrole bij mensen en, in mindere mate, bij knaagdieren. Een eenzijdige verlaging van één piramide resulteert in het verlies van CST innervatie van het ruggenmerg vooral aan de contralaterale zijde van het ruggenmerg die leidt tot voorbijgaande motorische handicap in de voorpoten en aanhoudende verlies van handvaardigheid. Ipsilaterale projecties van de corticospinale darmkanaal zijn van ondergeschikt belang. Wij hebben onze chirurgische methode om de kans op letsel volledigheid verhogen verfijnd. We beschrijven postoperatieve zorg. Tekorten op de Montoya trap pellet bereiken test en de horizontale ladder-test hier getoond worden gedetecteerd tot 8 weken postinjury. Tekorten op de cilinder opfok-test worden alleen kortstondig gedetecteerd. Daarom kan de cilindertest alleen geschikt zijn voor de detectie van herstel op korte termijn. We laten zien hoe, elektrofysiologischen anatomisch, men kan laesies en plastische veranderingen te beoordelen. We beschrijven ook hoe vezels van de niet gewonde CST kiemen over de middellijn in de achtergestelde gebieden te analyseren. Het is moeilijk om> 90% van de lesies steeds hetzij vanwege de nabijheid van de basilaire slagader in de medulla oblongata overlevingskansen kan laag zijn. Alternatieve chirurgische benaderingen en gedragsmatige testen worden beschreven in dit protocol. De pyramidotomy model is een goed hulpmiddel voor het beoordelen van neuroplasticiteits inducerende behandelingen, die kiemen van intacte vezels te verhogen na een blessure.

Introduction

De corticospinal darmkanaal (CST) is een belangrijke motor van de luchtwegen in het menselijk ruggenmerg. Schade aan dit traktaat na dwarslaesie resulteert in een aanzienlijk verlies van handvaardigheid. De CST is vooral belangrijk voor fijne motoriek bij mensen, zoals cijfer beweging en distale spiercontrole. Het wordt ook gevonden in knaagdieren maar anatomische locatie binnen het ruggenmerg verschilt van die van de mens en CST schade minder uitschakelen 1-4.

Een in vivo model van CST schade omvat eenzijdige pyramidotomy, waar men piramide in de ventrale hersenstam rostraal van de decussation (figuur 1) wordt gesneden. De piramides zijn een duidelijke anatomische functie op de ventrale zijde van het verlengde merg waardoor de CST loopt voordat het decussates. Bij ratten worden de meeste vezels (ongeveer 95%) kruisvormig aan het caudale einde van de medulla en vervolgens in de dorsale mediale deel van het ruggenmerg. Echter, approximatEly 10% van de decussated vezels lopen in de dorsolaterale kolommen. De resterende ~ 5% van de vezels blijven uncrossed aan de ipsilaterale zijde en reizen in het ventrale mediale deel 5,6. Na pyramidotomy het ruggenmerg verliest zijn directe input van de contralaterale CST (figuur 1).

De pyramidotomy model is bijzonder goed voor het testen van de respons van de intacte vezels van de unlesioned CST een behandeling. Hiermee beoordeling van plasticiteit en kiemen van de intacte vezels over de middellijn in het ruggenmerg, waarbij de gedenerveerde gebieden innerveren. De corticospinal darmkanaal is waargenomen aanzienlijk ontkiemen in dwarslaesie modellen en bemiddelt vooral voorpoot herstel 7-10. Een behandeling zou willen dit voorpoot herstel te verbeteren. De werkzaamheid van een behandeling kan worden getest met gedragsproblemen assessments, anatomische tracing technieken van de unlesioned darmkanaal en de terminal elektrofysiologische experimenten 3,11,12. </ P>

Het voordeel in vergelijking met de meeste andere preklinische modellen van letsel aan de ruggengraat is dat het specifiek treft een landstreek in vergelijking met andere ruggegraatsverwondingen vaak ingrijpende gevolgen meerdere stukken. Slechts één kanaal in een heldere, oppervlakkige anatomische locatie wordt laesie. Een ander voordeel is dat de pyramidotomy is een reproduceerbare letsel model. Het is een geschikte in vivo bron voor onderzoekers om het effect van potentiële neuroplasticiteits inducerende therapieën, die gericht zijn op het herstel van de motorische functie na blessures of aandoeningen van het bewegingsapparaat 13,14 testen.

Protocol

Ethische verklaring: Alle procedures waren in overeenstemming met de richtlijnen van het Britse ministerie van Binnenlandse Zaken en Dieren (wetenschappelijke procedures) Act van 1986. 1. Chirurgie en Verwondingen OPMERKING: Gebruik ratten zwaarder dan 220 g kunnen helpen bij postoperatief herstel indien de chirurg vaststelt dieren verliezen vaak meer dan 10% van hun preoperatieve lichaamsgewicht. Voor de operatie, het testen van de dieren voor hun voorpoot voorkeur met de cilinder opfok-test 15 of de Montoya staicase-test 24. Bij voorkeur, snijd de piramide / de CST die overeenkomt met de dominante voorpoot. OPMERKING: Twee dagen vóór de ingreep, plaats de volgende in de kooien, waardoor de ratten vertrouwd raken met voedingsmiddelen die uiteindelijk tijdens het herstel na een operatie zijn: hydrogel packs, natte puree en calorierijk voedingssupplementen. Steriele versies van deze voedingssupplementen zijn verkrijgbaar bij verschillende leveranciers. Verdoven vrouwelijke LIster kap ratten (gewicht tussen 200 en 250 g) met isofluraan (5% inductie en 1-2% voor onderhoud) zuurstof (stroomsnelheid: 1,5 l / min). OPMERKING: De keuze van anesthesie is belangrijk. Inhalatieverdovingsmiddel sneller maakt regeling van de diepte van anesthesie dan ketamine, die ook vaak wordt gebruikt. Isofluraan zorgt voor een betere controle van de ademhalingsfrequentie en diepte. De keuze van het verdovingsmiddel isofluraan. OPMERKING: Gebruik ratten zwaarder dan 220 g kunnen helpen bij postoperatief herstel indien de chirurg vaststelt dieren verliezen vaak meer dan 10% van hun preoperatieve lichaamsgewicht. Carprofen subcutaan toedienen als analgeticum bij de dieren verdoofd ontsteking verminderen en analgesie. Opmerking: Carprofen wordt gegeven tijdens pyramidotomy chirurgie in ons laboratorium op basis van advies van onze dierenarts. Opioïden misschien verder depressie luchtwegen veroorzaken tijdens de operatie. Handhaaf de dieren op 37 ° C tijdens de operatie via een siteothermic deken systeem en een rectale temperatuursensor. Bevestig volledige verdoving door te controleren op de poot snuifje terugtrekking reflex en de knipperreflex. Opmerking: Optioneel: ademhalingsproblemen tijdens de operatie, intubatie en ventilatie tegen te gaan haalbaar zou kunnen zijn. Echter, in gedachten houden dat de luchtpijp moet worden verplaatst tijdens de operatie. Eenmaal verdoofd, plaats de rat in een rugligging, scheer het ventrale nek en steriliseer het met 1% chloorhexidine doekjes en / of alcohol doekjes. Breng een steriele chirurgische deken over het dier en houdt het gebied steriel te allen tijde. Eenmaal verdoofd, plaats de rat in een rugligging, scheer het ventrale nek en steriliseer het met 1% chloorhexidine en alcohol doekjes. Breng een steriele chirurgische deken over het dier en houdt het gebied steriel te allen tijde. OPMERKING: Optioneel kan het hoofd van de rat in een stereotaxisch frame in rugligging worden vastgesteld tijdens een operatie om de mobiliteit van het hoofd, dat wil zeggen uit te schakelende occipitale bot. Voeg een 2-3 cm lange middellijn incisie van de kin tot bijna rostrale einde van het borstbeen met een steriele scalpel (# 10). Optioneel, breng een kleine bulldog klemmen aan de huid te trekken. Blunt ontleden de bovenste lagen van weefsel zoals klieren (bv onderkaak klier en oorspeekselklier) en spieren die de luchtpijp met omgekeerde werking met stompe schaar en getande pincet. Blijf altijd op de middellijn. De weefsels moeten gemakkelijk te scheiden. Zodra de trachea wordt blootgesteld, verplaatsen het opzij. De middellijn is zichtbaar eronder met twee witte vetkussentjes, het markeren van de middellijn aan de rostrale einde. Rostraal van de witte vetkussentjes, wordt stompe ontleden tissue totdat het ventrale oppervlak van de schedel (de basioccipital bot) bereikt. Plaats lange getande oprolmechanismen (tand lengte 5.5 mm of 16 mm) om de luchtpijp verplaatst naar een zijde (maximaal 1 cm) houden en de basis van de schedel bloot te leggen. Verplaatsing van de trachea obstruct ademhaling. OPMERKING: Voor sommige dieren, maak de retractors op meerdere momenten tijdens de operatie om de spanning gedurende 2 minuten te verwijderen op de luchtpijp, bijvoorbeeld elke 10 min. Hook oprolmechanismen worden gebruikt in plaats van de lange tanden oprolmechanisme aan de stam van verplaatsing te beperken. Zorgvuldig cauterize kleine zichtbare bloedvaten op de rostrale einde gaat naar het strottenhoofd om het bloeden te voorkomen. Opmerking: Om te voorkomen dichtschroeien de terugkerende larynx zenuw bloedvaten voorzichtig weggetrokken van de weefselwand voordat ze worden dichtgeschroeid. Stel de microscoop voor de rest van de operatie. Verwijder het periosteum over de basis van de schedel met fijne pincet. Pas de retractors om de best mogelijke weergave voor het boren te bereiken. Voel de oneffen oppervlak van de basioccipital bot met fijne tang, en merkt een verhoging aan de middellijn, die de basilaire slagader dekt. Rostraal, raakt de schedel opgevoed als een lichte bolling. Afhankelijk van welke kant de laesie gewenst, een gat ongeveer 1 mm lateraal van de middellijn in mediolateral bewegingen. LET OP: Vergeet niet dat de rat is in rugligging, en zijn linkerkant kunnen worden op de onderzoekers rechterkant! Nadat een gat is gemaakt, uitbreiden richting de middellijn met kleine verticale op- en neerwaarts-bewegingen met de boor totdat de basilaire slagader duidelijk zichtbaar en vergroten zijdelings ten minste 2 mm. Controleer de basilaire slagader duidelijk zichtbaar. De piramide kan worden geïdentificeerd door zijn licht uitpuilende vorm (figuur 2) en door de aangrenzende bloedvaten. Verwijder alle resterende botfragmenten met fijne pincet. Breng één druppel Doxapram hydrochloride, een respiratoire stimulerend op de tong. Open de dura lengterichting met een 26 gauge naald en fijne tang lateraal van de basilaire slagader. Geniet van de cerebrospinale vloeistof (CSF) en eventuele bloeden met wattenstaafjes. Het vermijden van injury om de basilaire slagader, maken een snede ongeveer 1,5 mm breed verspreid over de breedte van de piramide en 0,5 mm diep met Vannas Spring Schaar loodrecht op de basilaire slagader (figuur 2) naar de CST vezels onderbreken. OPMERKING: Markeer de microscissors vooraf op 0,5 mm van de tips. Zodra de dura wordt geopend de basilaire slagader kan enigszins worden verplaatst naar een zijde een betere toegang tot de piramide. Herhaal de snede met de punt van een 26 gauge naald te zorgen voor de laesie omvat de vezels nabij de basilaire slagader. Het bloeden te stoppen met lichte druk door wattenstaafjes toegepast. Eventueel kan de snede worden bedekt met gelfoam. Verwijder de retractors, vervang de weefsels en hechtdraad alleen de huid met 3-0 Vicryl hechtingen. Na de operatie, houdt het dier in een incubator bij 32 ° C tot ze volledig wakker en beheren 5 ml zoutoplossing subcutaan, indien nodig. Laat het dier niet alleen laten. Geef Carporfen subcutaanals een anti-inflammatoire en als pijnstiller voor de post-operatieve pijn een dag postsurgery. Nauw voor een week te monitoren dieren na de operatie en vervolgens ten minste eenmaal per week. Zoals vereist na de operatie, plaats hydratatie gel packs, gepureerde babyvoeding, slobber en droog chow op kooi vloer. Zorg voor water flessen met lange tuiten (ontbreekt kogellager kleppen).

Representative Results

Overlevingskansen. In een representatief onderzoek uitgevoerd door ons hadden we een overlevingskans van 16 van de 20 vrouwelijke Lister hooded ratten (200 tot 250 g). De meest voorkomende complicatie ademhalingsproblemen vanwege de trachea verplaatsing of schade aan de respiratoire centra in de hersenstam juist dorsaal naar de piramides (nucleus solitarii, dubbelzinnig en parabrachilis). Soortgelijke resultaten zijn gerapporteerd in de literatuur 16. Behavioural uitkomsten. Een reeks gedragstesten werden gebruikt sensomotorische uitkomst na pyramidotomy bij knaagdieren beoordelen: de horizontale ladder test de interne korrel bereiken proef de cilinder kweek test- en Montoya trap test de meest gebruikte gedrags evaluaties. Andere tests in de literatuur beschreven zijn de pellet bereiken test, touwklimmen test, ganganalyse en de plakband-test3,17-19. De meeste van deze tonen een functionele motor tekort 1 week na het letsel. Momenteel hebben de meeste studies in de literatuur beschreven andere eigenschappen gedragstesten tot 42 dagen 4,11,13,20,21 of minder lang 3,18,22. We hebben gedragstesten uitgevoerd gedurende een langere tijd en in wezen volledig herstel van motorische functie 8 weken na pyramidotomy enkele van de gedragstesten gezien, behalve Montoya trap test en de horizontale ladder test. Dit is waarschijnlijk om verschillende redenen. Ten eerste kan de gewonde CST rostraal van de laesie synapsen op neuronen in de hersenstam die indirecte relais motorneuronen treden in het ruggenmerg vormen. Ten tweede kan de niet gewonde (contralaterale) CST ontkiemen en vormen synapsen op de neuronen in de hersenstam of het ruggenmerg die fungeren als relais aan motorische neuronen. Ten derde, andere gespaard motor traktaten zoals de reticulospinal, vestibulospinale of rubrospinale traktaten kan over een aantal functies te nemen. Aldus blijvende tehandeling effect is moeilijk te detecteren met vele gedragstesten in de pyramidotomy model. Een aantal gedragstesten in dit model kon echter versneld herstel vroeg na het letsel, die gerelateerd is aan een behandeling te geven. Cilinder Grootbrengende testen 3,4,23 Op basis van de cilinder opfok-test de CST die overeenkomt met de dominante voorpoot raakte gewond. Ratten worden in een plexiglas cilinder geplaatst en fokken gedrag wordt waargenomen gedurende een periode van 3 min. Preinjury er een lichte voorkeur voor het gebruik van een voorpoot, de dominante voorpoot tijdens verticale exploratie (Figuur 3A). De schade beïnvloedt de dominante zijde en het gebruik van de contralesional voorpoot daalde tot 28% na 1 week postinjury (herhaalde metingen ANOVA p <0.05; post-hoc analyse onthulde dieren significant tekorten in week 1, 2 en 3, p <0,05, Fisher's LSD). 4 weken postinjury de dieren hersteld van eend die de getroffen voorpoot 45% van rears, en na 6 weken was 57% (n = 16, gemiddelde ± standaard fout wordt getoond). Evenzo Starkey et al. (4) zijn beoordeeld muizen met de cilindertest tot 42 dagen na pyramidotomy en een significante daling van het gebruik van de aangedane voorpoot gedurende de gehele testperiode. Montoya Trap-test 24 Ratten vereisen vooropleiding voor deze test om te acclimatiseren voordat letsel. Om de motivatie te verhogen tijdens de testsessie dieren voedsel beperkt tot 15 g voedsel per rat de avond tevoren. Het voedsel verstoken ratten worden in de Montoya trap geplaatst gedurende 15 min. Aan elke zijde is er een trap van 7 stappen putjes, elk 3 pellets. Het totale aantal opgehaalde pellets aan weerszijden worden geregistreerd. Het aantal opgehaalde pellets met de contralesional / beïnvloed voorpoot aanzienlijk gedaald van 61% preinjury aan3% 3 dagen postinjury (figuur 3B). De mogelijkheid om pellets te halen was nog steeds significant beïnvloed bij 4 weken postinjury met 20% van de pellets opgehaald. Ratten vertonen een aanzienlijk tekort tot week 8 met slechts 29% van de pellets gegeten op dat tijdstip (herhaalde metingen ANOVA p <0.05, post hoc analyse bleek dieren aanzienlijke verliezen op de contralesional kant helemaal weken, p <0,05, Fisher's LSD). De ipsilesional voorpoot wordt beïnvloed tot 1 week postinjury; maar dit herstelt door de tweede week (herhaalde metingen ANOVA p <0,05, post hoc analyse bleek dieren hebben grote tekorten op dag 3 en week 1 op de ipsilesional voorpoot, p <0,05, Fisher's LSD). De initiële tekorten van de ipsilesional voorpoot kan worden verklaard door de laesie van de ipsilaterale deel van corticospinale darmkanaal die door de snede piramide, met daaropvolgend kiemen en herstel. HorizontaalLadder-test 25 Ratten vereisen vooropleiding voor deze test. Ratten lopen drie keer meer dan een 1 meter lange ladder met onregelmatige sport afstand. Video's worden later in slow motion en het totale aantal van mond slips en missers voor elke poot geanalyseerd wordt gekwantificeerd. De grafiek in figuur 3C is het totale aantal missers en enten van de getroffen en minder aangedane zijde (voorpoot + achterpoot) als percentage van het totale aantal stappen. Ratten hebben een significant verhoogd aantal fouten respectievelijk 1 week postinjury met 10% of 11% op de aangedane zijde en minder aangedane zijde. Dit tekort is persistent op contralesional / getroffen kant tot week 8 met 10% fouten, maar lost op ipsilesional / minder aangedane zijde van 2 weken (herhaalde metingen ANOVA, post hoc analyse bleek dieren significant tekorten helemaal weken de contralesional zij- en significant tekorten in week 1 en 3 op de ipsilesionalkant, p <0,05, Fisher's LSD). Elektrofysiologische testen In een terminal elektrofysiologische set-up van het dier werd intraperitoneaal verdoofd met urethaan. Tijdens de gehele procedure werd bij 37 ° C ± 1 ° C gehouden. De ventrale halsgebied, haar voorpoten en borst regio werden geschoren en ontsmet met jodium scrub. De piramides werden blootgesteld zoals eerder beschreven en de radiale zenuw werd blootgesteld in de bovenarm van een ventrale benadering insnijden van de huid en de pectoralis major. Het distale uiteinde van de radiale zenuw werd gesneden en de zenuw werd verdeeld over twee zilveren draad aansluiting elektroden in een minerale olie bad. Ofwel piramide gestimuleerd met concentrische bipolaire elektrodes op verschillende diepten met 5 pulsen bij 300 Hz en toenemende stimulatie amplitude. Opnames zijn altijd gemaakt van de radiale zenuw van de gehandicapte arm (Figuur 4). Ongedeerd animals een sterke respons op vertragingen tussen 12 tot 20 msec in de radiale zenuw bij de contralaterale piramide gestimuleerd (figuur 4B). Ipsilaterale stimulatie resulteert slechts in incidentele activering (Figuur 4C). Dieren die voorheen met pyramidotomies, aan de contralaterale zijde om de opname arm vertonen geen respons in de radiale zenuw bij de laesie kanaal boven de laesie (figuur 4B) wordt gestimuleerd. Echter, stimulatie van de CST vezels in de piramides ipsilaterale de registrerende elektroden tot een sterkere activering in de radiale zenuw opzichte van niet-gewonde dieren 12 weken postinjury (Figuur 4C). Anatomische resultaten. De dieren werden gedood 10 weken postsurgery volgens bijlage 1 van de Dieren (wetenschappelijke procedures) Act 1986. Twee weken eerder werd het ongedeerd CST getraceerd met gebiotinyleerddextran amine (BDA) injecties in de motorische cortex 26 ipsilateraal aan de gehandicapte arm (figuur 1). Dit maakt kwantificering van niet-beschadigde vezels die de middellijn kruisen en leveren de contralesional ruggenmerg (figuur 5C, D). Ongedeerd dieren hebben maar een paar vezels oversteken van de middellijn, terwijl dit verhoogt in reactie op letsel. Transversale cervicale ruggenmerg secties werden gekleurd met proteïne kinase C (PKC) gamma het aandeel van denervatie in de laesie CST (figuur 5E) 16 beoordelen. Alternatief kan de volledigheid van de laesie worden beoordeeld door het injecteren BDA tracer in de motorische cortex van de ipsilesional zijde van de pyramidotomy schade. De afwezigheid van etikettering in de contralaterale dorsomediale CST en de ipsilaterale ventromedial CST levert het bewijs van volledige eenzijdige doorsnijding. <img alt="Figuur 1" fo:conte nt-width = "4in" src = "/ files / ftp_upload / 51843 / 51843fig1highres.jpg" width = "400" /> Figuur 1: Schematische voorstelling toont de corticospinale traktaten in de rat en de eenzijdige axotomie van de CST in de piramides Top afbeelding:. Corticospinale neuronen afkomstig uit de corticale laag 5 piramidale cellen. Gebiotinyleerd dextran amine (afgebeeld in groen) wordt geïnjecteerd in de contralesional cortex twee weken vóór het einde van het experiment. Midden afbeelding: De stukken vormen de piramides op het ventrale oppervlak van het merg en aan het spinomedullary knooppunt de meerderheid van de axonen kruisvormig. Eenzijdige pyramidotomy wordt uitgevoerd in de caudale medulla (in rood aangegeven). Onderste afbeelding: De meerderheid van de corticospinale traktaten beneden draaien in de dorsomediale en dorsolaterale delen van het ruggenmerg. Een minderheid blijft ipsilateraal en loopt ventromedially. 1843fig2highres.jpg "width =" 500 "/> Figuur 2: Ventral weergave van de hersenen rat. De piramides zijn onderscheidende, omdat ze worden opgevoed, parallel convexiteiten (gele doos). De randen van de piramiden zijn mediaal gedefinieerd door de basilaire slagader (bas) over de middellijn en lateraal aan de basis van de convexiteit halverwege de basilaire slagader en de paraolivary slagader (pol) zoals in (C). Craniotomie wordt uitgevoerd over de basilaire slagader en lateraal te breiden tot de paraolivary slagader (rode doos in C). Een piramide loodrecht gesneden om de basilaire slagader (rode lijn C wordt gesneden getoond model in A en B). Laesies te caudaal in de buurt van de vertebrale slagaders (vert) geplaatst zal onvolledig zijn, omdat de CST begint te kruisvormig en omdat de vertebrale slagader wordt ingesteld vanaf de middellijn. (C) Afbeelding aangepast van "The Rat Nervous System" door George Paxinos 27. OPMERKING: Deze figuur toont een letsel aan de linkerkant van de beelden: dit is tuig van het dierht piramidebaan want het is rugligging. Let echter op dat de video toont een laesie op links piramidebaan van het dier. Figuur 3:. Representatieve resultaten voor de cilinder opfok test, Montoya trap pellet bereiken testen en horizontale ladder-test Er is een motor tekort gedetecteerd door alle tests na een blessure. Er kan echter geen tekort worden gedetecteerd met de cilinder opvoeding test op 4 weken postinjury, terwijl aanhoudende tekorten kunnen worden gedetecteerd met de Montoya trap test en de horizontale ladder-test tot 8 weken postinjury (n = 16 per groep, middelen en standaard fout zijn getoond). Asterisk geeft p <0,05 ten opzichte van preinjury basislijn (Fisher's LSD-test). Klikhier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 4:. Electrofysiologie beoordelen van de corticospinale darmkanaal voor en na pyramidotomy (A) toont de set-up voor de terminal experiment. We stimuleren de piramides met een trein van 5 pulsen op verschillende diepten rostraal van de plaats van laesie en decussation. De rood-darmkanaal is de laesie-darmkanaal. We nemen vanaf de radiale zenuw aan de contralesional kant. (B) en (C) laten bijvoorbeeld opnames met ipsilesional stimulatie of contralesional stimulatie voor of 12 weken na pyramidotomy. Ipsilesional stimulations roepen meerdere verbinding actiepotentialen (pieken in het spoor) in de radiale zenuw voordat letsel (B). Deze worden afgeschaft door de blessure en de activiteit niet return binnen 12 weken (B '). Contralesional stimulatie oproept zeldzame enkele verbinding actiepotentialen preinjury (C). 12 weken na het letsel activiteit aanzienlijk wordt verhoogd (C '), mogelijk als gevolg van intacte axonen kiemen over de middellijn en plastische veranderingen binnen het ruggenmerg. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 5:. Anatomische evaluatie na pyramidotomy (A, B, C, D) gebiotinyleerd dextraan amine werd gebruikt om de corticospinale tractus traceren door injecteren in de motorische cortex overeenkomt met de unlesioned CST (zie groene figuur 1). De dorsale mediale, de ventrale mediale componenten van het CST zijn duidelijk zichtbaar (A, dorsale mediale deel vergroot in B). (C) en (D) zijn vergrotingen van (A) vezels kiemen over de middellijn in de grijze stof van de gedenerveerde zijde in reactie op een behandeling. Om de volledigheid van de laesie dwarsprofielen van de cervicale niveau 4 (12 weken postinjury weefsel) te evalueren werden gesneden en gekleurd met antilichamen tegen PKC gamma (E). De CST aan de linkerkant van het beeld is intact en kan gezien worden uitpuilende over de middellijn in de gedenerveerde kant, vermoedelijk als gevolg van de structurele desintegratie van de gewonde dorsale CST.

Discussion

We hebben de pyramidotomy letsel model beschreven. Het corticospinale kanaal wordt gesneden ter hoogte van de hersenstam. Vanuit een technisch oogpunt deze operatie vergt veel voorzichtigheid en nauwkeurigheid. De hersenstam herbergt de ademhalingscentra en cardiovasculaire centra in meerdere kernen zoals de nucleus dubbelzinnig en solitarii ingebed in de reticulaire formatie onder de piramiden. Als de snede gemaakt te diep dit kan leiden tot plotselinge ademhalingsmoeilijkheden, die fataal kunnen zijn. We geven Dopram net voordat de snede om de ademhaling te verhogen tot een plotselinge ademhaling stoppen te voorkomen. Als de ademhaling stopt het is de moeite waard het ventileren van het dier voor de volgende vijf minuten met zuurstof als het kan herstellen. Bovendien beschadiging van de basilaire slagader moet absoluut vermeden. Complicaties tijdens de eerste paar dagen postinjury zijn: een andere bloeding in de hersenstam die vitale functies, aanzienlijk gewichtsverlies, ernstige ademhalingsproblemen difficulties vanwege luchtpijp verplaatsing en ernstige oriëntatie en problemen met het evenwicht van het dier als gevolg van uitgebreide letsel, met inbegrip van de olijven net lateraal van de piramides. Deze complicaties kunnen worden behandeld als eindpunten en dieren humaan kunnen worden gedood. Sluiten monitoring tijdens de eerste week na de operatie noodzakelijk. Aanvullende voeding kan worden gegeven om gewichtsverlies te compenseren. Luchtwegontsteking (raspende ademhaling) normaal lost binnen een tot twee dagen. Algemeen jongere dieren makkelijker te bedienen als de nek minder diep. Bovendien zijn ze veerkrachtiger en minder ademhaling complicaties.

Het vereist enige oefening om een ​​complete laesie van de CST te bereiken met een pyramidotomy. Ook in twee studies door Steward et al. 16, die uitgaat van een voormalige experiment kopiëren door Benowitz et al. 28 gemeld aanvankelijk hoge sterfte en sommige van de laesies onvolledig waren. Gedragswetenschappentekorten zal ook variabel zijn. We raden aan dat een nieuwe chirurg voert veel praktijk pyramidotomy operaties voordat een volledige experiment om een ​​kandidaat therapie test wordt uitgevoerd. Manieren om incomplete laesies voorkomen worden natrekken van de snede met een injectienaald en zorg dat de corticospinale vezels dicht bij de basilaire slagader worden doorgesneden, zoals beschreven in dit protocol. Andere opties zijn de laesie te zuigen met een tip glas zuigpipet zoals beschreven in Zhou et al. 2003 29. Een fijne wolfraam draad kan ook worden gebruikt om het kanaal 22 te snijden. Een alternatief voor pyramidotomy is om de cervicale C3 dorsale CST eenzijdig knippen en vervolgens te snijden met een ventrale benadering de ipsilesional C2 ventrale deel van de CST 18. Maar misschien wel, een complete laesie is niet nodig als het doel is om het kiemen van de contralesional CST te bestuderen; als de meerderheid van de piramide laesie en kiemen reactie van de unlesioned kant treedt dit kan voldoende zijn.

Een doel van de pyramidotomy laesie model is aan één zijde van de corticospinale tractus ablateren en gebruik neuroplasticiteits inducerende therapieën om de plasticiteit en kiemen van het intacte niet-gewonde vezels stimuleren. Om neuroprotectieve therapieën testen dit model is ongeschikt en andere schade modellen zoals contusie verwondingen worden gebruikt. Uitkomsten van pyramidotomies worden meestal beoordeeld met gedrags-testen en anatomie. De horizontale ladder test, de cilinder kweek test- en Montoya trap test de meest gebruikte gedrags evaluaties. Andere tests in de literatuur beschreven zijn de pellet bereiken test, touwklimmen test, ganganalyse en de plakband-test 3,17-19. De resultaten van meest gedragstest vaak pas bewaakt maximaal 42 dagen postlesion 3,4,11,17,18,20-22. Van ervaringen uit het verleden, knaagdieren herstellen de meeste functie op latere tijdstippen zonder enige behandeling interventie. We hebben laten zien that de horizontale ladder test en de Montoya trap pellet bereiken testen opsporen van handicaps tot een later tijdstip. Ze kunnen worden gebruikt om functioneel herstel meten door een behandeling. De laesie volledigheid wordt beoordeeld door PKC gamma kleuring van het ruggenmerg (die CST vezels in de dorsale kolommen etiketten) en rostrale cervicaal of eriochroomcomplex cyanine kleuring van dwarsdoorsneden van de laesie. Gebiotinyleerde dextran amine kan worden geïnjecteerd in de contralesional cortex de kiemen van het intacte vezels over de middellijn beoordelen in de gedenerveerde ruggenmerg gebied.

Kortom, de pyramidotomy model is goed voor de beoordeling van neuroplasticiteits inducerende capaciteiten van een behandeling drug voor het centrale zenuwstelsel verwondingen als de operatie succesvol is onder de knie. Zij beoordeelt plasticiteit van intacte vezels. De volgende stap is om een ​​klinisch relevant model gebruikt zoals contusie verwondingen van het geneesmiddel dan grotere injuri overwinnen beoordelenes die meerdere stukken.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door het International Spinal Research Trust en de Rosetrees Trust.

Materials

Carprofen Norbrook Vm No; 02000/4229 give 5mg/kg twice daily
Homeothermic Blanket System Harvard Instruments 507222F
Isoflurane Abbott B506
Fine Scissors- Tough Cut Fine Science Tools 14058-09
Forceps Fine Science Tools 11019-12
Long-toothed Alm retractors Fine Science Tools 17009-07
cautery system kit Harvard Instruments 726067
fine Dumont forceps Fine Science Tools 11251-10
Carbon Steel burrs Fine Science Tools 19007-07
Dopram V-drops Pfizer apply 1 drop to tongue
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-03
gelfoam Equimedical EQU705001
3-0 Vicryl sutures Ethicon
operating microscope Zeiss
Compact Anaesthesia System Isoflurane K/F Single Gas VetTech Solutions
Scales Ohaus NVT3201
Carbon Steel Scalpel blades No. 10 Swann-Morton 201
25g needles Terumo NN-2525R
syringes (1ml and 5ml) Terumo SS+01T1 / SS*05SE1
Saline (Sodium Chloride 0.9%) Fresenius Kabi Pl 08828/0178
cotton buds Johnson and Johnson 5000207582502 sterilize before use
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lemon, R. N. Descending pathways in motor control. Annual review of neuroscience. 31, 195-218 (2008).
  2. Lemon, R. N., Griffiths, J. Comparing the function of the corticospinal system in different species: organizational differences for motor specialization. Muscle & nerve. 32, 261-279 (2005).
  3. Starkey, M. L., et al. Assessing behavioural function following a pyramidotomy lesion of the corticospinal tract in adult mice. Experimental neurology. 195, 524-539 (2005).
  4. Starkey, M. L., Bartus, K., Barritt, A. W., Bradbury, E. J. Chondroitinase ABC promotes compensatory sprouting of the intact corticospinal tract and recovery of forelimb function following unilateral pyramidotomy in adult mice. Eur J Neurosci. 36, 3665-3678 (2012).
  5. Brosamle, C., Schwab, M. E. Cells of origin, course, and termination patterns of the ventral, uncrossed component of the mature rat corticospinal tract. The Journal of comparative neurology. 386, 293-303 (1997).
  6. Brosamle, C., Schwab, M. E. Ipsilateral, ventral corticospinal tract of the adult rat: ultrastructure, myelination and synaptic connections. Journal of neuroctology. 29, 499-507 (2000).
  7. Bareyre, F. M., et al. The injured spinal cord spontaneously forms a new intraspinal circuit in adult rats. Nat Neurosci. 7, 269-277 (2004).
  8. Chen, Q., Smith, G. M., Shine, H. D. Immune activation is required for NT-3-induced axonal plasticity in chronic spinal cord injury. Exp Neurol. 209, 497-509 (2008).
  9. Z’Graggen, W. J., et al. Compensatory sprouting and impulse rerouting after unilateral pyramidal tract lesion in neonatal rats. J Neurosci. 20, 6561-6569 (2000).
  10. Rosenzweig, E. S., et al. Extensive spontaneous plasticity of corticospinal projections after primate spinal cord injury. Nat Neurosci. 13, 1505-1510 (2010).
  11. Z’Graggen, W. J., Metz, G. A., Kartje, G. L., Thallmair, M., Schwab, M. E. Functional recovery and enhanced corticofugal plasticity after unilateral pyramidal tract lesion and blockade of myelin-associated neurite growth inhibitors in adult rats. J Neurosci. 18, 4744-4757 (1998).
  12. Kartje-Tillotson, G., O’Donoghue, D. L., Dauzvardis, M. F., Castro, A. J. Pyramidotomy abolishes the abnormal movements evoked by intracortical microstimulation in adult rats that sustained neonatal cortical lesions. Brain Res. 415, 172-177 (1987).
  13. Thallmair, M., et al. Neurite growth inhibitors restrict plasticity and functional recovery following corticospinal tract lesions. Nature Neuroscience. 1, 124-131 (1998).
  14. Akbik, F. V., Bhagat, S. M., Patel, P. R., Cafferty, W. B., Strittmatter, S. M. Anatomical plasticity of adult brain is titrated by Nogo Receptor 1. Neuron. 77, 859-866 (2013).
  15. Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacol. 39, 777-787 (2000).
  16. Steward, O., Sharp, K., Yee, K. M. A re-assessment of the effects of intracortical delivery of inosine on transmidline growth of corticospinal tract axons after unilateral lesions of the medullary pyramid. Experimental neurology. 233, 662-673 (2012).
  17. Thallmair, M., et al. Neurite growth inhibitors restrict plasticity and functional recovery following corticospinal tract lesions. Nature neuroscience. 1, 124-131 (1998).
  18. Weidner, N., Ner, A., Salimi, N., Tuszynski, M. H. Spontaneous corticospinal axonal plasticity and functional recovery after adult central nervous system injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3513-3518 (2001).
  19. Schnell, L., Schneider, R., Kolbeck, R., Barde, Y. A., Schwab, M. E. Neurotrophin-3 enhances sprouting of corticospinal tract during development and after adult spinal cord lesion. Nature. 367, 170-173 (1994).
  20. Starkey, M. L., Bleul, C., Maier, I. C., Schwab, M. E. Rehabilitative training following unilateral pyramidotomy in adult rats improves forelimb function in a non-task-specific way. Experimental neurology. 232, 81-89 (2011).
  21. Ueno, M., Hayano, Y., Nakagawa, H., Yamashita, T. Intraspinal rewiring of the corticospinal tract requires target-derived brain-derived neurotrophic factor and compensates lost function after brain injury. Brain : a journal of neurology. 135, 1253-1267 (2012).
  22. Maier, I. C., et al. Constraint-induced movement therapy in the adult rat after unilateral corticospinal tract injury. J Neurosci. 28, 9386-9403 (2008).
  23. Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
  24. Montoya, C. P., Campbell-Hope, L. J., Pemberton, K. D., Dunnett, S. B. The "staircase test": a measure of independent forelimb reaching and grasping abilities in rats. Journal of neuroscience methods. 36, 219-228 (1991).
  25. Soblosky, J. S., Song, J. H., Dinh, D. H. Graded unilateral cervical spinal cord injury in the rat: evaluation of forelimb recovery and histological effects. Behavioural brain research. 119, 1-13 (2001).
  26. Soleman, S., Yip, P., Leasure, J. L., Moon, L. Sustained sensorimotor impairments after endothelin-1 induced focal cerebral ischemia (stroke) in aged rats. Experimental neurology. 222, 13-24 (2010).
  27. Paxinos, G. . The Rat Nervous System. , (1995).
  28. Benowitz, L. I., Goldberg, D. E., Madsen, J. R., Soni, D., Irwin, N. Inosine stimulates extensive axon collateral growth in the rat corticospinal tract after injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 13486-13490 (1999).
  29. Zhou, L., Baumgartner, B. J., Hill-Felberg, S. J., McGowen, L. R., Shine, H. D. Neurotrophin-3 expressed in situ induces axonal plasticity in the adult injured spinal cord. J Neurosci. 23, 1424-1431 (2003).

Tags

Corticospinal TractPyramidotomyNeuroplasticityMotor FunctionBehavioral TestingAnatomical AnalysisElectrophysiologyRodentsSpinal Cord Injury

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Kathe, C., Hutson, T. H., Chen, Q., Shine, H. D., McMahon, S. B., Moon, L. D. F. Unilateral Pyramidotomy of the Corticospinal Tract in Rats for Assessment of Neuroplasticity-inducing Therapies. J. Vis. Exp. (94), e51843, doi:10.3791/51843 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image