Åpent felt aktivitetsnivå brukes til å vurdere lokomotiv og atferdsaktivitetsnivå. Denne protokollen gir et godt designet, standardisert protokoll som skal brukes i prekliniske studier for nevromuskulære lidelser.
Det åpne feltet aktivitet overvåkingssystem grundig vurderer bevegelses og atferdsaktivitetsnivå av mus. Det er et nyttig verktøy for å vurdere lokomotiv svekkelse i dyremodeller av nevromuskulær sykdom og effekt av medisiner som kan forbedre bevegelse og / eller muskelfunksjon. Det åpne feltet aktivitetsmåling gir et annet mål enn muskelstyrke, som ofte vurderes av gripestyrke målinger. Det kan også vise hvordan legemidler kan påvirke andre kroppens systemer, så vel når det brukes med ekstra utfallsmål. I tillegg tiltak som total distanse speile 6 min gangtest, en klinisk studie effektmål. Imidlertid er åpent felt aktivitet overvåking også forbundet med betydelige utfordringer: Open feltaktivitetsmålinger varierer i henhold til dyr belastning, alder, kjønn, og døgnrytmen. I tillegg kan romtemperatur, fuktighet, lys, støy og til og med lukt påvirke utfallet vurderings. Samlet denne manuscript gir en godt testet og standardisert åpent felt aktivitet SOP for prekliniske studier i dyremodeller av nevromuskulære sykdommer. Vi gir en diskusjon av viktige hensyn, typiske resultater, dataanalyse og detalj de styrker og svakheter ved åpent felt testing. I tillegg gir vi anbefalinger for optimal studiedesign ved bruk av åpent felt aktivitet i en preklinisk studie.
Dyremodeller har vært nyttig for å lære om sykdomsmekanismer, men deres nytte i å forutsi virkningen av behandling i kliniske studier har ofte blitt utfordret 1-3. Mange "lovende" prekliniske studier er publisert hvert år; Men svært få av de foreslåtte tiltakene viser positive resultater når flyttet til klinisk utprøving. Disse avvikene er ofte tilskrives publikasjonsskjevhet, overoptimistisk konklusjoner, og dårlig utformet og gjennomført pre-kliniske studier som fører til uforklarlige resultater 1-3.
Med dagens fremskritt innen legemiddelutvikling for nevromuskulære lidelser, er det et økende behov for godt designede prekliniske studier. Spesielt er det et behov for strenge metoder som kan gjennomføres i et standardisert og blindet måte, med validerte, reproduserbare og oversett effektmål. Som medlem av den Medfødt muskelsykdom Consortium, medønsket om å gjennomføre strengere prekliniske studier, deler vi her vår Standard Operating Procedure (SOP) for Open Feltet aktivitet. Denne SOP ble tidligere validert 4 og publisert som en del av TREAT-NMD er SOP for Duchenne muskeldystrofi (DMD) dyremodeller fem. Vi har brukt denne metoden til å fenotype og teste den terapeutiske effekt av en rekke medikamenter i en rekke dyremodeller av neuromuskulære sykdommer, inkludert Lama2 dy-2J / J (Dy2J) mus, en dyremodell for medfødt muskeldystrofi (CMD) 6,7 . I sin tur, denne artikkelen tilpasset fra vår tidligere utgitt TREAT-NMD SOP 5.
Det åpne feltet aktivitet overvåkingssystem grundig vurderer bevegelses og atferds aktivitet hos mus, noe som kan være forbundet med lokomotiv funksjon. Testen er også mye brukt for å vurdere angst ut og utforskende atferd 8-10. Spesielt det åpne feltet er et nyttig verktøy for assessing lokomotiv verdifall i dyremodeller av nevromuskulær sykdom 11,12 og effekten av terapeutiske legemidler som kan forbedre bevegelse og / eller motorisk funksjon 6,7,13,14. Det åpne feltet aktivitetsvurdering gir et annet mål enn muskelstyrke, som ofte måles med grep styrke, og det viser hvordan legemidler kan påvirke andre kroppens systemer (dvs. sentralnervesystemet) samt fem. I tillegg, det åpne feltet aktivitetstiltak, total distanse, speiler 6 min gangtest, en klinisk studie effektmål, som fokuserer på submaksimal trening ytelse og livskvalitet 15,16. Totalt dette gjør det åpne feltet aktivitet teste en gunstig sekundær eller hjelpe effektmål å bruke i prekliniske studier. Imidlertid har det åpne feltet aktivitet overvåking system også betydelige utfordringer knyttet til den. Testen er atferdsmessige og kan være ganske variabel som det er påvirket av et mangfold av eksternfaktorer. For eksempel kan dette problemet bli påvirket av utforskende kjøring (dvs. kognisjon), angst, sykdom, døgnrytme, miljøfaktorer, genetisk bakgrunn, i tillegg til motoreffekt 10. Som et resultat er det viktig å gjennomføre dette tiltaket på en standardisert måte med et kontrollert miljø. Protokollen presenteres her beskriver vårt åpne feltaktivitet SOP i detalj. Det gir trinnvise prosedyrer og nærmere omtale av viktige hensyn å kontrollere miljøforhold og bidra til å redusere variabiliteten, typiske resultater, dataanalyse, og vurderingen styrker og svakheter i mer detalj.
Det åpne feltet aktivitetsmåling er en in vivo-forsøk som kan være gunstig for å vurdere sykdomsutvikling og legemidlets effekt i dyremodeller av nevromuskulær sykdom 6,7,11-14. Som vist i figur 2, gir det en vurdering av aktivitet som vanligvis reflekterer lokomotiv funksjon. Dette er et annet mål enn muskelstyrke, noe som gjør det til et ideelt sekundær eller hjelpe effektmål å utføre i en preklinisk narkotika studie. I tillegg er det en klinisk relevant 15, ikke-invasiv måling, noe som kan utføres flere ganger i løpet av varigheten av et studium. Imidlertid er atferds og lokomotiv aktivitet også påvirket av andre faktorer i tillegg (dvs. eksperimentator håndtering, miljøforhold, og kognisjon) skaper variasjon i åpent feltaktivitetsdata. Målet med denne artikkelen er å gi en godt testet og standardisert protokoll som reduserer variasjon og gir resultater å være compared tvers av flere laboratorier, i håp om å forbedre oversettelsen innen vårt felt.
En hovedulempe med dette tiltaket er at det er svært variabel, og påvirkes av en rekke eksterne faktorer. Men vi tok hensyn til dette når du utvikler protokollen. Vi vurderte en rekke testprotokoller som varierer i varighet 1-5 dager med datainnsamling. Til slutt fant vi ut at å utføre instrument akklimatisering før datainnsamling til å bli kjent dyrene med testkammeret miljø og utøvende 4 dager med datainnsamling betydelig redusert mengden av variasjon i utfallsdata fem. Denne protokollen ble opprinnelig utviklet for å vurdere atferdsmessige og lokomotiv aktivitet i mdx mus modell; Imidlertid ble denne protokollen nylig validert i Dy2J dyremodell samt seks. Det er foreslått at protokollen standardiseres i din lab for hvert dyr modell før du bruker den i en preklinisk studie.
Åpent felt aktivitet varierer med genetisk bakgrunn 17, kjønn 18-20, 18 år, og døgnrytmen 21. Dette krever dyr av samme alder, kjønn og genetisk bakgrunn som skal vurderes på samme tid. Under planlegging, bør forsiktig tanke settes i å avgjøre i hvilken alder eller aldre åpent felt aktivitetsnivået vil bli vurdert. Hvert dyr modell har sin egen distinkte sykdomsprogresjon og lokomotiv og atferds fenotype, som varierer i alvorlighetsgrad og etter alder 6,15 (figur 2 og figur 3). Derfor er det viktig å bestemme klinisk og patologisk relevante tidspunkter for å vurdere åpent felt aktivitet tiltak. Det totale antall dyr som trengs i hver behandlingsgruppe for å detektere statistisk signifikante forskjeller varierer fra dyremodell, alder og kjønn i tillegg. Derfor bør relevante beregninger utvalgsstørrelsen også utføres under planlegging å determine det totale antall dyr som trengs i hver behandlingsgruppe for å detektere statistisk signifikante forskjeller. Disse beregningene bør også ta hensyn til ekstra utfallsmål brukt i studien (f.eks grep styrke målinger eller histologiske analyser). Basert på våre beregninger makt, vi bruker vanligvis 10-12 dyr per behandlingsgruppe. I tillegg bør det tas spesielt hensyn til hva kontroll belastning er brukt i studien. Det er en tendens til uriktig kontrollstammer som skal brukes i prekliniske studier. For eksempel er BL6 mus ofte brukt som en kontroll påkjenning for mdx mus; derimot, er det MDX-mus på en BL10 bakgrunn. Som vist i figur 3, BL10 mus er mye mer aktive enn BL6 mus, noe som gjør det umulig å sammenligne MDX og BL6 data. Ved utføring av prekliniske studier med MDX mus, bør BL10 mus brukes som kontroll belastning. Videre, hvis en studie blir utført med Dy2J mus, BL6 musene bør brukes som kontrol belastning.
Små endringer i miljøet kan også ha betydelig innvirkning aktivitetsnivå. Disse inkluderer belysning, temperatur, fuktighet, lukt, støy og menneskelig aktivitet 4,15. Derfor er det meget viktig at testing kan utføres i et temperatur-og fuktighetskontrollert rom med ikke-direkte belysning på samme tid hver dag fem. Testkamre bør være jevnt fordelt i hele rommet og ikke under direkte belysning eller i skyggen eller mørke hjørner fem. Dyr bør være tilfeldig plassert i sine testkamre hver dag for å redusere virkningene av varierende miljøforhold i hele rommet, og de bør få lov til å akklimatisere seg til testrommet i 10-30 min før datainnsamlingen. Sørg for å spore boksen tildeling av hvert dyr under hele studien for å sikre at enhver påvirkning av boks / miljø er likt fordelt mellom de ulike behandlingsgruppene. Individene lasting av animals i testkamre og håndtering av dyr i hele varigheten av studien bør bli blindet til behandlingsgruppen, og belastningen dyr når det er mulig. I mange tilfeller er berørt genotyper er vesentlig forskjellig fra tilknyttede kontroller og blinding er ikke mulig. Men enkeltpersoner bør alltid bli blindet mellom behandlede og ubehandlede grupper. Videre bør alle personer forlate rommet under datainnsamlingen for å redusere støy og forstyrrelser i rommet, og alle kamrene må rengjøres grundig etter hver økt datainnsamling. Disse tiltak vil i betydelig grad redusere variasjoner i dataene. Det er viktig å merke seg at dyrene er også svært utsatt for 15 tilpasning. Derfor er det foreslått at dyr tas ut av prøvekammeret direkte etter 60 min for datainnsamling hver dag, og det åpne feltet aktivitet vurderes ikke mer enn en gang i måneden.
Den totale distansen og total flytteringstidsmålinger har en tendens til å være de mest sensitive åpent felt aktivitetsmålinger fem. I Dy2J modellen, tenderer den vertikale aktivitetsmåling for å være den mest følsomme åpne feltet aktivitet mål (figur 3); Imidlertid, kan det være vanskelig å fange opp nøyaktige vertikale aktivitetsmålinger i mindre dyr. For eksempel er det mulig at en mindre dyr vil oppvise stell oppførsel og sensoren vil ikke innta den på grunn av høyden av den vertikale sensor. Som et resultat, anbefaler vi at du tester dyr tidligst fem uker gamle. Det er også mulig at et dyr vil sove gjennom hele varigheten av en datasamling økt. Hvis dette er tilfelle, er det hensiktsmessig å legge til en ekstra dag med datainnsamling. Endelig kan dårlig innretting av kvadranten divider eller blokkering av sensorer inne i boksen resultere i unøyaktige data i tillegg. Derfor er det meget viktig å utføre en sensor precheck, før testing, og gjennom alle data etter avsluttethver datainnsamling økt.
Forsiktighet bør også utvises ved å analysere åpne feltet aktivitetsdata. Åpent felt aktivitet data har en tendens til å være ikke-normalfordelt og har uteliggere fire. Før du utfører noen statistiske analyser, våre biostatisticians anbefaler sjekke dataene for normalitet og uteliggere. Hvis data er ikke-normalfordelt, bør man vurdere å benytte en parametrisk test når man sammenligner midler. I tillegg bør alle dataene bli analysert av en individuell blindet til det som behandlingsgruppene er.
Samlet har det åpne feltet aktivitet tiltaket store fordeler: a) det er en helhetlig vurdering av både bevegelses og atferds aktivitet, noe som er sterkt, men ikke alltid korrelert med lokomotiv funksjon; b) det er en enkel mål å utføre; c) det krever ingen dyr håndtering under testing; d) det er en ikke-invasiv måling som kan utføres mer enn én gang i løpet av varigheten av et study; e) ingen spesiell opplæring er nødvendig for å utføre testen; f) flere dyr kan testes på en gang; og g) det er en klinisk relevant effektmål 5,16. Men når jeg tester therapeutics, husk at andre faktorer kan påvirke et dyrs atferd, og i sin tur åpne feltet aktivitetsmålinger. Legemidler kan ha CNS og eller andre kropps brede effekter, og situasjonen kan også påvirkes av en stressende miljø. Som et resultat, kan det være vanskelig å skille dersom endringer i lokomotiver eller adferds aktivitet er relatert til forandringer i muskelfunksjon, muskelstyrke, eller er en følge av bivirkninger av legemidlet. Derfor bør ytterligere funksjonelle, histologiske og eller molekylære assay bli utført i tillegg. Dette standardisert protokoll har også blitt brukt i andre muskelsykdommer 4,17; Imidlertid, som vist i figur 3, pilotstudier skal utføres først å vurdere følsomheten av måle i dyretmodell.
The authors have nothing to disclose.
Denne publikasjonen er finansiert gjennom Cure CMD, fransk Muscular Distrophy Association (AFM), en translasjonsforskning stipend fra muskeldystrofi Association, National Institutes of Health (1K26RR032082, 1P50AR060836-01, 1U54HD071601, 2R24HD050846-06), Department of Defense ( W81XWH-11-1-0330, W81XWH-11-1-0782, W81XWH-10-1-0659, W81XWH-11-1-0809, W81XWH-09-1-0599) og en pilot stipend fra Parent Prosjekt Muscular Distrophy ( PPMD).
Dette papir er en av flere i en rekke SOP for rutinemessig brukt metoder i medfødt muskelsykdommer feltet. Det gjenspeiler innsatsen diskutert og etablert av over 20 eksperter på området medfødt muskelsykdom på de siste Medfødt muskelsykdom Consortium Workshop, som arrangeres i april 2013 i Washington, DC
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Equipment | |||
VersaMax Open Field Activity Monitoring system with acrylic test chambers, and X, Y, Z axis sensors | AccuScan Instruments, Inc. Columbus Ohio, USA | Retired | |
Fusion Open Field Activity Monitoring system with acrylic test chambers, and X, Y, Z axis sensors | Omnitech Electronics, Inc. Columbus Ohio, USA | Suggested system currently on the market | |
Computer | Dell, Inc. | ||
Materials | |||
Virkon-S Broad spectrum disinfectant (Potassium Peroxymonosulfate/ Sodium Chloride) | Pharmacal Research Laboratories, Inc. | ||
Mice | |||
B6.WK-Lama2dy-2J/J (Dy2J) | Jackson Lab | 000524 | |
C57BL/6J (BL6) | Jackson Lab | 000664 | |
SJL/J (SJL) | Jackson Lab | 000686 | |
C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J (mdx) | Jackson Lab | 001801 | |
C57BL/10ScSnJ (BL10) | Jackson Lab | 000476 |