Hög kapacitet analys till Phenotype<em> Salmonella enterica</em> Typhimurium Association, Invasion och replikering i Makrofager
Summary
En hög genomströmning analys för in vitro-fenotyp Salmonella eller annan bakteriell förening, invasion, och replikation i fagocyterande celler med hög genomströmningskapacitet utvecklades. Metoden användes för att utvärdera Salmonella gen knockout mutantstammar för deras inblandning i värd-patogen interaktioner.
Abstract
Salmonella arter är zoonotiska patogener och vanliga orsaker till livsmedelsburna sjukdomar hos människor och djur 1. Att förstå mekanismerna bakom Salmonella -host interaktioner är viktigt att belysa den molekylära patogenesen av Salmonella infektion. Den Gentamicin skyddsanalys fenotyp Salmonella förening, invasion och replikering i fagocytceller anpassades för att möjliggöra hög throughput screening för att definiera roller deletionsmutanter av Salmonella enterica serotyp Typhimurium i värdinteraktioner som använder RAW 264.7 makrofager från mus. Enligt detta protokoll, variansen i mätningar reduceras signifikant jämfört med det standardprotokoll, eftersom vildtyp och multipla mutanta stammar kan testas i samma odlingsskål och samtidigt. Användning av multikanalspipetter ökar genomströmningen och förbättrar precisionen. Dessutom farhågor relaterade till att använda mindre host celler per brunn i 96 brunnar odlingsskål behandlades. Här, protokollet av den modifierade in vitro Salmonella invasion analys med användning fagocytceller framgångsrikt används för att fenotypen 38 individuella mutanter Salmonella radering associerings, invasion och intracellulär replikering. De in vitro fenotyper presenteras, av vilka några var därefter bekräftats ha in vivo fenotyper i en djurmodell. Således, för att det modifierade, standardiserade test fenotypen Salmonella förening, invasion och replikation i makrofager med hög genomströmningskapacitet skulle kunna användas mer allmänt för att studera bakterie värd interaktioner.
Introduction
Nontyphoidal Salmonella är viktiga orsaker till tarmsjukdomar i alla ryggradsdjur. Salmonellainfektion hos människor är bland de bakteriella livsmedelsburna sjukdomar 1. Karaktärisering av de molekylära mekanismer som ligger till grund för interaktioner av salmonella med sina djurvärdar uppnås främst genom studier av Salmonella enterica serotyp Typhimurium (STM) i vävnadsodling och djurmodeller av infektion. Att få inblick i STM-värd interaktioner kommer att hjälpa oss att förstå hur Salmonella överleva och växa inuti värdceller. Den första utmaningen i att studera dessa interaktioner är att identifiera så många medverkande faktorer som möjligt från både värd och patogen, men dessa ansträngningar till stor del hindras av de stora svårigheterna med att hantera två oberoende komplexa biologiska system samtidigt, det vill säga, värd och Salmonella, under fysiologiska betingelser. Dessutom, det stora repertoire av salmonella och värdgener potentiellt kodar faktorer som värd interaktioner kräver hög genomströmning biologisk plattform för att ta itu med denna utmaning.
En modifierad, standardiserad analys för att fenotypen Salmonella förening, invasion och replikation i makrofager med hög genomströmningskapacitet utvecklades för att undersöka ett stort antal gener sannolikt bedriver Salmonella -host interaktioner. Den Gentamicin skyddsanalys utvecklades 1973 2, men först grundligt beskriven av Elsinghorst 1994 3,4. Det har nu blivit ett standardverktyg för att studera många intracellulära bakteriella patogener ex vivo, inklusive Salmonella 5,6. Internaliserade bakterier undgå att dödas av vissa antibiotika, såsom gentamicin, som inte kan tränga eukaryota celler 3. Genom att utnyttja detta fenomen, det Gentamicin skyddsanalys mäter överlevnad och tillväxt av intracellulär bacterial patogener. Tre händelser under infektionen, dvs association med eukaryota celler, invasion och replikation, kan utvärderas för intracellulära bakteriella patogener baserat på tidsintervallet mellan infektion, Gentamicin behandling, och ytterligare inkubation (Figur 1). Eukaryota cellinjer ger en fysiologisk miljö som är mindre komplicerad än relevanta djurmodeller för värd-patogen interaktionsstudier.
Den Gentamicin skyddsanalys är en lämplig plattform för att studera STM-värdinteraktioner, men den standardanalys i en 24-brunnars odlingsplatta har låg genomströmningskapacitet. Beräkningsanalys av in vivo datauppsättningar identifierade 149 Salmonella genprodukter som är förutsagda att interagera med ca 300 värd genprodukter (opublicerade data). Standarden Gentamicin skyddsanalys har inte kapacitet att fenotypen detta antal mutanter effektivt.
I addition kan Gentamicin skyddsanalys teoretiskt upptäcka invasionen av en enda bakterie. På grund av denna inneboende känslighet, rådata är känsliga för tekniska avvikelser när upprepades vid olika tidpunkter. Den interna kontrollen och relativ presentation av data efter normalisering är väsentliga för en meningsfull tolkning av resultaten. Mot bakgrund av detta infördes en modifierad, standardiserad Gentamicin skyddsanalys utvecklas för att öka testkapaciteten och ökar precisionen.
Följande protokoll är detaljerade och illustrerade för att fullfölja det ändrade Gentamicin skyddsanalys med användning av 96 brunnar odlingsplattor och murina makrofag RAW264.7 cellinje. Jämfört med standardprotokollet i 24-brunnars odlingsplattor, har det modifierade protokollet följande fördelar: 1) Med hjälp av 96 brunnar odlingsplattor tillåter upp till 10 olika mutantstammar som ska phenotyped inklusive interna positiva och negativa kontroller med tillräcklig statistisk styrka;2) Variansen för resultat är signifikant, eftersom de mutanta stammar testas på samma odlingsskål och på samma gång; 3) Användningen av multikanalspipetter ökar genomströmningen och minskar förarens trötthet. Slutligen, att jämföra med 24 brunnar odlingsplattor, var oro mindre värdceller per brunn i 96-väl odlingsskål hanteras genom protokolloptimering och standardisering.
Sammanfattningsvis modifierade, standardiserade test in vitro fenotyp Salmonella eller annan bakteriell förening, invasion och replikering i fagocytceller ökar precisionen och uppnår hög genomströmningskapacitet och samtidigt minska påfrestningen på föraren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den Gentamicin skyddsanalys i stor utsträckning används för att studera invasionen och replikering av intracellulära bakteriella patogener inuti värdcellen, och det är särskilt en viktig biologisk verktyg för att studera patogener, som Salmonella, vars invasion är förutsättningen steget för upprättandet infektion 1. Standarden Gentamicin skyddsanalys i Salmonella forskarsamhället genomförs i 24-väl odlingsskål 5. Även om användningen av 48 eller till och med 96-…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Projektet stöddes dels av ett bidrag för National Institutes of Health NIAID (för AJB och LGA, R01 AI076246). Den Salmonella mutant samlingen delvis med stöd från National Institutes of Health bidrag (för MM, U01 A152237-05, R01 AI07397-01, R01 AI039557-11 och R01 AI075093-01), dels av National Institutes of Health bidrag (för HAP, R21 AI083964-01, 1R0 1AI083646-01, 1R56AI077645, R01 AI075093). Vi tackar Steffen Prowollik för replik plätering och bekräfta mutanter i samlingen.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965 | |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30910.03 | |
| T-75 cell culture flask vented filter cap | Nest Biotechnology | 708003 | |
| 100X Non-Essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
| Cell scraper | BD Falcon | 353086 | |
| 96-well cell culture plate | Corning Incorporated | 3595 | |
| Luria-Bertani (LB) broth | MP Biomedicals | 3002-075 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | BD Falcon | 352059 | |
| PBS pH7.4 (1x) | Life Technologies | 10010 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Kanamycin solution | Sigma | K0254 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1272 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 |
References
- Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. Salmonellae interplay with host cells. Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).
- Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. The Journal of clinical investigation. 52, 1673-1679 (1973).
- Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods Enzymol. 236, 405-420 (1994).
- Elsinghorst, E. A., Weitz, J. A. Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic Escherichia coli tib locus is associated with a 104-kilodalton outer membrane protein. Infect Immun. 62, 3463-3471 (1994).
- Behlau, I., Miller, S. I. A PhoP-repressed gene promotes Salmonella typhimurium invasion of epithelial cells. J Bacteriol. 175, 4475-4484 (1993).
- Hueck, C. J., et al. Salmonella typhimurium secreted invasion determinants are homologous to Shigella Ipa proteins. Mol Microbiol. 18, 479-490 (1995).
- Steele-Mortimer, O. Infection of epithelial cells with Salmonella enterica. Methods Mol Biol. 431, 201-211 (2008).
- Foster, J. W., Spector, M. P. How Salmonella survive against the odds. Annu Rev Microbiol. 49, 145-174 (1995).
- Edwards, A. M., Massey, R. C. Invasion of human cells by a bacterial pathogen. Journal of visualized experiments JoVE. 10, (2011).
- Molinari, G., et al. The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells. Mol Microbiol. 40, 99-114 (2001).
- Van der Velden, A. W., Lindgren, S. W., Worley, M. J., Heffron, F. Salmonella pathogenicity island 1-independent induction of apoptosis in infected macrophages by Salmonella enterica serotype typhimurium. Infect Immun. 68, 5702-5709 (2000).
- Santos, R. L., Zhang, S., Tsolis, R. M., Baumler, A. J., Adams, L. G. Morphologic and molecular characterization of Salmonella typhimurium infection in neonatal calves. Vet Pathol. 39, 200-215 (2002).
- Lawhon, S. D., et al. Role of SPI-1 secreted effectors in acute bovine response to Salmonella enterica Serovar Typhimurium a systems biology analysis approach. PLoS One. 6, e26869 (2011).
- Drecktrah, D., Knodler, L. A., Galbraith, K., Steele-Mortimer, O. The Salmonella SPI1 effector SopB stimulates nitric oxide production long after invasion. Cell Microbiol. 7, 105-113 (2005).
