Real-Time Impedantie-gebaseerde Cell Analyzer als een instrument af te bakenen moleculaire pathways betrokken bij neurotoxiciteit en Neuroprotectie in een neuronale cellijn,
Summary
Improved in vitro neurotoxicity assays would aid the identification of new neuroprotective compounds. The utility of a real-time impedance-based cell analyzer to determine cytotoxicity and cytoprotection in neuronal cell lines and to delineate the involvement of second messenger pathways, thus gaining insight in the mechanism of neuroprotection is presented.
Abstract
Veel hersenen gerelateerde aandoeningen hebben neuronale celdood betrokken bij hun pathofysiologie. Verbeterde in vitro modellen voor neuro-of neurotoxische effecten van drugs en downstream pathways die betrokken zou helpen inzicht te krijgen in de moleculaire mechanismen van neuroprotection / neurotoxiciteit en kan mogelijk de ontwikkeling van geneesmiddelen te vergemakkelijken bestuderen. Echter, veel van de bestaande in-vitro-toxiciteit testen hebben grote beperkingen – de meeste beoordelen neurotoxiciteit en neuroprotection op een enkel tijdstip, niet toe te staan om het tijdsverloop en de kinetiek van het effect waarnemen. Bovendien zou de mogelijkheid om informatie over de downstream signaling pathways betrokken bij zenuwbescherming in real-time verzamelen van groot belang zijn. In het huidige protocol beschrijven we het gebruik van een real-time impedantie gebaseerde cell analyzer neuroprotectieve effecten van serotonine 2A (5-HT2A) receptor agonisten in een neuronale cellijn onder-label vrij en real-time condit bepalenionen met impedantiemetingen. Verder tonen we aan dat remmers van second messenger pathways kan worden om downstream moleculen betrokken bij de neuroprotectieve effect bakenen. We beschrijven ook de bruikbaarheid van deze techniek te bepalen of een effect op celproliferatie bij tot een waargenomen neuroprotectieve effect. Het systeem maakt gebruik van speciale micro platen aangeduid als E-platen die bevatten afwisselend gouden micro-elektrode arrays aan de onderkant van de putjes, die als mobiele sensoren. De impedantie uitlezing wordt gemodificeerd door het aantal hechtende cellen, cellevensvatbaarheid, morfologie en hechting. Een dimensieloze parameter genaamd Cell Index is afgeleid van de elektrische impedantiemetingen en wordt gebruikt om de status cel bevindt. Over het algemeen, de real-time-impedantie gebaseerde cel analyser zorgt voor real-time, label-free beoordeling van neuroprotectie en neurotoxiciteit, en de evaluatie van de second messenger pathways betrokkenheid, bij te dragen aan meergedetailleerd en high-throughput worden mogelijke neuroprotectieve verbindingen in vitro, voor het selecteren therapeutische kandidaten.
Introduction
Neuronale celdood speelt een belangrijke rol in de pathofysiologie van vele hersenen gerelateerde aandoeningen 1. De beschikbaarheid van betrouwbare en high-throughput in vitro de toxiciteit testen is van cruciaal belang om een beter inzicht te krijgen in de mechanismen van neurotoxiciteit en te helpen selecteren neuroprotectieve moleculen als therapeutische kandidaten in de ontwikkeling van geneesmiddelen 2. Er zijn veel beperkingen meest gebruikte in vitro neurotoxiciteit assays.They beoordelen neurotoxiciteit / neuroprotectie op een tijdpunt niet toestaan kinetische resolutie; vaak gebruik etiket of probe die kan interfereren met de signaalwegen en beperken aanvullende studies in dezelfde celpopulatie en die vaak arbeidsintensief, en in veel gevallen niet voorzien mechanistisch inzicht. In de onderhavige studie tonen we het nut van een real-time impedantie gebaseerde cell analyzer neurotoxiciteit en neuroprotectie in een neuronale cellijn in real-time en onder bepalen labelvrijeomstandigheden en om inzicht te geven in downstream mechanismen door middel van analyse van de second messenger pathways betrokken bij de werking.
Eerdere studies hebben de geldigheid van de real-time cell analyzer bevestigd cytotoxiciteit en effecten op celproliferatie in cellijnen vastgesteld in vergelijking met standaard technieken 3,4,5,6. Zo werd een goede correlatie waargenomen tussen uitlezingen van de standaard cellevensvatbaarheid WST-1 test en Cell Index waarden op verschillende tijdstippen onder basale omstandigheden proliferatie en na twee verschillende toxische paradigma in HeLa-cellen 3. In A549 en MDA-MB-231 cellen proliferatie en cytotoxiciteit uitgelokt met de microtubuli stabilisator paclitaxel toonde zeer vergelijkbaar waarden wanneer beoordeeld door Cell Index metingen en het standaard gebruikte sulforhodamine B (SRB) test 4. In de neuronale cellijn van geïmmortaliseerde hippocampale neuronen werden HT-22 Cell Index metingen gevalideerd op hun vermogen to detecteren celproliferatie, glutamaat cytotoxiciteit en celbescherming tegen de gebruikte 3-(4,5-dimethyl-2-yl) 2,5-difenyltetrazolium-bromide (MTT) test 5. In dezelfde studie de MTT assay resultaten en Cell Index metingen ook goed gecorreleerd meten neuronale progenitorcellen proliferatie, cytotoxiciteit na groeifactoren ontbering en redden van cytotoxiciteit door de pan-caspase inhibitor QVD 5. Cytotoxiciteit geïnduceerd in NIH 3T3 cellen door Vandetanib (vasculaire endotheliale groeifactor receptor en epidermale groeifactor receptor remmer) een vergelijkbaar resultaat gemeten Cell Indexwaarden of neutrale rode opname test 6.
We hebben onlangs gebruikt de real-time cell analyzer systeem neuroprotectieve effecten van serotonine 2A beoordelen (5-HT2A) receptor agonist (±) -2,5-dimethoxy-4-joodamfetamine hydrochloride (DOI) in een neuronale cellijn ( SK-N-SH cellen) en gescreend op de betrokkenheid van second boodschapper paden door het monitoren van de effecten van hun chemische remming van de waargenomen neuroprotection 7. Interessant is dat de 5-HT2A receptor zowel hallucinogene nonhallucinogenic agonisten (zoals DOI en lisuride, respectievelijk), die zowel de gemeenschappelijke en specifieke second messenger pathways 8 kan activeren.
De voordelen van de voorgestelde techniek is dat het mogelijk maakt om real-time informatie over celoverleving verzamelen gedurende de dag, af te bakenen tweede messenger pathways betrokken, de mogelijke bijdrage van proliferatie effecten neuroprotectie beoordelen en om een optimale tijd selecteren extra eindpunt studies op dezelfde celpopulatie. Een schematisch diagram van de werkstroom in het huidige protocol is weergegeven in figuur 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het huidige protocol presenteert het nut van een real-time mobiele analyzer om continu en onder-label-vrije omstandigheden de neuroprotectieve / neurotoxische effecten van verbindingen in neuronale cellijnen te beoordelen en om inzicht te krijgen in de tweede boodschapper die betrokken zijn bij de werking.
Hoewel het nut real-time cell analyzer tot cytotoxiciteit en de effecten van geneesmiddelen op celproliferatie studie wordt algemeen erkend, slechts enkele studies in neuronale verwante ce…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financial support for the experiments presented in the study was provided by the Marie Heim-Vögtlin program of the Swiss National Science Foundation.
We thank Ms. Johanna Nyffeler for developing a set of modified MATLAB programs for screening for statistically significant differences in real-time cell analyzer’s data and Dr. Yama Abassi for helpful discussion.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| xCELLigence RTCA SP system bundle | ACEA Biosciences | No: 00380601030 | consists of RTCA Analyzer, RTCA SP Station and RTCA Control Unit |
| E-plate 96 | ACEA Biosciences | No: 05232368001 | for culturing the cells, inserted in the RTCA SP Station |
| SK-N-SH cells | ATCC – (in partnership with LGC Standards) | HTB-11 | can be replaced by another adherent neuronal cell line of interest |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D8437 | cell culture medium |
| fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-063 | supplements proliferation, but not serum deprivation medium |
| tisue culture flask T175 | Sarstedt | 83.1812.302 | for culturing cells, which will be later plated on the E-Plate 96 |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | for trypsinization of cells cultured in tissue culture flasks |
| Scepter 2.0 cell counter | Merck Millipore | PHCC20060 | automated cell counter |
| phosphate-buffered saline | Life Technologies | 10010-015 | for washing the cells |
| (±)-DOI hydrochloride | Sigma-Aldrich | D101 | 5-HT2A agonist for cell culture treatment |
| LY-294,002 hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9908 | PI3-K inhibitor for cell culture treatment |
| lisuride maleate | Tocris Bioscience | 4052 | compound with 5-HT2A agonistic activity for cell culture treatment |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | for dissolving LY-294,002 and lisuride maleate |
References
- Cavallucci, V., D’Amelio, M. Matter of life and death: the pharmacological approaches targeting apoptosis in brain diseases. Curr. Pharm. Des. 17 (3), 215-229 (2011).
- Bull, S. HPA CHaPD 001: Review of Environmental Chemicals and Neurotoxicity. Focus on Neurological Diseases. , (2007).
- Ke, N., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. A. The xCELLigence system for real-time and label-free monitoring of cell viability. Methods Mol. Biol. 740, 33-43 (2011).
- Limame, R., et al. Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays. PLoS One. 7 (10), e46536 (2012).
- Diemert, S., et al. Impedance measurement for real-time detection of neuronal cell death. J. Neurosci. Methods. 203 (1), 69-77 (2012).
- Kustermann, S., et al. A label-free, impedance-based real time assay to identify drug-induced toxicities and differentiate cytostatic from cytotoxic effects. Toxicol In Vitro. 27 (5), 1589-1595 (2013).
- Marinova, Z., Walitza, S., Grünblatt, E. 5-HT2A serotonin receptor agonist DOI alleviates cytotoxicity in neuroblastoma cells: role of the ERK pathway. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 44, 64-72 (2013).
- González-Maeso, J., et al. Hallucinogens recruit specific cortical 5-HT(2A) receptor-mediated signaling pathways to affect behavior. Neuron. 53 (3), 439-452 (2007).
- Tsuchioka, M., Takebayashi, M., Hisaoka, K., Maeda, N., Nakata, Y. Serotonin (5-HT) induces glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) mRNA expression via the transactivation of fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2) in rat C6 glioma cells. J. Neurochem. 106 (1), 244-257 (2008).
- Galante, D., et al. Differential toxicity, conformation and morphology of typical initial aggregation states of Aβ1-42 and Aβpy3-42 beta-amyloids. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 44 (11), 2085-2093 (2012).
- Sheline, C. T., Cai, A. L., Zhu, J., Shi, C. Serum or target deprivation-induced neuronal death causes oxidative neuronal accumulation of Zn2+and loss of NAD. Eur. J. Neurosci. 32, 894-904 (2010).
