إجراء بأحجام صغيرة للتركيز الفيروسي من المياه
Summary
An approach was developed for identifying optimal viral concentration conditions for small volume water samples using spikes of human adenovirus. The techniques described here are used to identify concentration parameters for other viral targets, and applied to large-scale viral concentration experimentation.
Abstract
Small-scale concentration of viruses (sample volumes 1-10 L, here simulated with spiked 100 ml water samples) is an efficient, cost-effective way to identify optimal parameters for virus concentration. Viruses can be concentrated from water using filtration (electropositive, electronegative, glass wool or size exclusion), followed by secondary concentration with beef extract to release viruses from filter surfaces, and finally tertiary concentration resulting in a 5-30 ml volume virus concentrate. In order to identify optimal concentration procedures, two different electropositive filters were evaluated (a glass/cellulose filter [1MDS] and a nano-alumina/glass filter [NanoCeram]), as well as different secondary concentration techniques; the celite technique where three different celite particle sizes were evaluated (fine, medium and large) followed by comparing this technique with that of the established organic flocculation method. Various elution additives were also evaluated for their ability to enhance the release of adenovirus (AdV) particles from filter surfaces. Fine particle celite recovered similar levels of AdV40 and 41 to that of the established organic flocculation method when viral spikes were added during secondary concentration. The glass/cellulose filter recovered higher levels of both, AdV40 and 41, compared to that of a nano-alumina/glass fiber filter. Although not statistically significant, the addition of 0.1% sodium polyphosphate amended beef extract eluant recovered 10% more AdV particles compared to unamended beef extract.
Introduction
الفيروسات المعوية الإنسان هي العوامل المسببة هاما من الأمراض التي تنقلها المياه 1-3، ولكن عادة ما تكون موجودة بأعداد قليلة في المياه الملوثة البيئية، مما يجعل من الصعب الكشف عنها دون تركيز. الإجراءات المستخدمة للتركيز الفيروسات وعادة ما تشمل خطوة الترشيح، وتليها مرشح شطف، والتركيز الثانوي للشطافة التصفية. يعتمد إجراء الترشيح مشترك بشأن استخدام الأغشية المشحونة مثل مرشحات كهربي (استعرضت مؤخرا في 4،5). هذه الفلاتر تعتمد على التقاط الفيروسات العالقة في الماء باستخدام التفاعلات كهرباء بين سطح فلتر (موجبة) وجزيئات الفيروس المستهدفة (سالبة الشحنة). اثنين من المرشحات موجب الشحنة الكهربائية المتوفرة تجاريا تعتمد على هذه التكنولوجيا، والمرشحات الزجاج / السليلوز والنانو الألومينا / الألياف الزجاجية. تكاليف مرشح الزجاج / السليلوز ما يصل إلى 10 مرة من النانو الألومينا / الألياف الزجاجية، التي تحد من استخدام الزجاج / ممرشحات llulose لرصد فيروس الروتيني. وخلصت الدراسات التي أجريت مؤخرا الاختلافات الاسمية بين هذه الفلاتر اثنين في التعافي من الفيروسات المعوية من 6،7 المياه المحيطة، والتي تبرر استخدام مرشح بديل أرخص. وقد تم دراسة خيارات التصفية أخرى مثل مرشحات كهربية والزجاج والصوف، إلا أنها إما تتطلب المعالجة المسبقة لمصدر المياه (الفلاتر كهربية) أو ليست متاحة تجاريا (الفلاتر الزجاج الصوف). وضع إجراءات تركيز الفيروس قد ركزت في معظمها على تحسين تقنيات تركيز الابتدائية (الفلاتر) من أجل تحسين المستردة الفيروس من المياه. ومع ذلك، إجراءات تركيز الثانوية، والتي تقلل من حجم eluant عادة من 1 L لملليلتر مجلدات، ويمكن أيضا أن يكون لها تأثير كبير على المبالغ المستردة فيروس 8.
تركيز الثانوية من الفيروسات المعوية يعتمد عادة على وكيل المرسب مثل بعض أنواع من استخراج لحوم البقر (floccu العضويةlation) أو الحليب منزوع الدسم التلبد 9-12 لإزالة جزيئات الفيروس من الأسطح التصفية. مؤخرا، والإجراءات تركيز ثانوي آخر باستخدام مستخلص اللحم البقري إلى جانب إضافة celite (الجسيمات الدقيقة) وقد أظهرت الوعد لاستعادة اتش، المعوى، ونوروفيروس 8،13،14. Celite أعمال الاعتقال وفقا لمبادئ مماثلة لتلك التي من طريقة التلبد العضوي في أن جزيئات الفيروس نعلق على ويفرج من الجسيمات (الندف أو celite) عن طريق تغيير الرقم الهيدروجيني للمحلول تعليق. تم تقييم مقارنات بين هذه التقنيات تركيز الثانوية اثنين في استرداد اتش مسنبل (ADV) أنواع 40 و 41 8. وخلصت هذه الدراسة إلى أن اثنين من تقنيات تركيز الثانوية كانت مشابهة إحصائيا في التعافي من الفيروسات الغدية. ومع ذلك، يتطلب طريقة التلبد العضوية لمدة 30 دقيقة. حضانة في درجة الحموضة 3.5، في حين أن تقنية celite تتطلب الحضانة أقصر (10 دقيقة) في درجة الحموضة 4.0. وflocculat العضويةكما يتطلب أيون استخدام المعدات المختبرية المكلفة (أجهزة الطرد المركزي) لجمع الجسيمات الندف خلال التركيز العالي، والتقنية celite في المقابل تستخدم المعدات الأساسية فقط المختبر (الترشيح فراغ) لفصل الجسيمات celite من الايقاف.
تركيبات معينة من المرشحات وتقنيات شطف الثانوية يمكن أن يؤثر أيضا المستردة الفيروس. وخلصت إحدى الدراسات أن تركيبات معينة من الابتدائية (الفلاتر كهربي) وتقنيات تركيز الثانوية (celite أو التلبد العضوي) كان لها تأثير كبير على الانتعاش من اتش 13. وتشير هذه النتائج هو مطلوب أن الأمثل من أجل استرداد النحو الأمثل فيروس الهدف من مصفوفة المياه نظرا عند استخدام هذه التقنيات. الأمثل هو مضيعة للوقت، وتجنب عملية شاقة العديد من الباحثين بنشاط منذ سيتم تقييم العديد من المتغيرات (نوع مرشح / العلامة التجارية، ودرجة الحموضة حل شطف، celite / التلبد العضوي).
لهذا لياليtudy، تم وضع إجراءات لتحديد الظروف المثلى لتركيز الفيروس من المياه باستخدام اتش البشري مسنبل سلالات 40 و 41. ومن المفترض، لأن كل نوع الفيروس يعرض مورفولوجية قفيصة فريدة من نوعها ورسوم قفيصة معين، قد تحتاج بروتوكولات تركيز ليكون الأمثل لكل فيروس استهداف من أجل تحقيق الانتعاش الفيروسي الأمثل. وتقدم هذه الدراسة نهجا لADV 40 و 41 تركيز من قبل: 1) تقييم المبالغ المستردة الفيروس في ماء الصنبور باستخدام أقراص فلتر كهربي تليها 2) تقييم طريقة التلبد العضوي أنشئت مقابل تقنية celite بمثابة تركيز الثانوي، و 3) تقييم مخازن شطف للتركيز العالي.
Protocol
Representative Results
Discussion
مرشحات كهربي مفيدة في التركيز الفيروسات من الماء. ولكن هذه الفلاتر يمكن أن تختلف في بنيتها وتكوينها والتي يمكن بدورها تغير فعاليتها. ومما يزيد هذه المشكلة، والهياكل قفيصة والرسوم تختلف بين سلالات الفيروس التي تتطلب تقنيات تركيز تكون مصممة لضمان استرداد الأمثل 15.<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Nicholas J. Ashbolt and Dr. G. Shay Fout for their review of the manuscript.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Adenovirus 40 stock | ATCC | VR-931 | |
| Adenovirus 41 stock | ATCC | VR-930 | |
| Sodium Thiosulfate | Fluka Chemical Co. | 72051 | |
| Celites #577 | Fluka Chemical Co. | 22142 | |
| NanoCeram 47mm | Argonide | N/A | |
| 1MDS 47mm | 3M | 6408502 | |
| AP-20 Prefilter 47mm | Millipore Corp. | AP2004700 | |
| Glycine | Sigma | 50046-1KG | |
| Sodium Polyphosphate | Acros Organics | 390930010 | |
| Trypsin | Gibco | 25200 | |
| PBS | Sigma | P5368 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A481-212 | |
| BBL Beef Extract | BD Biosciences | 212303 | |
| Difco Beef Extract | BD Biosciences | 211520 | |
| ABI 7900 Real-time PCR system | ABI | N/A | |
| Stainless Steel Filter Housing | Millipore Corp. | XX2004720 | |
| Blood DNA Extraction Kit | Qiagen | 51104 | |
| EPA MPN Calculator | http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html |
References
- Sinclair, R. G., Jones, E. L., Gerba, C. P. Viruses in recreational water-borne disease outbreaks: a review. Journal of Applied Microbiology. 107, 1769-1780 (2009).
- WHO. . Guidelines for Safe Recreational Water Environments. , (2003).
- Westrell, T., et al. Norovirus outbreaks linked to oyster consumption in the United Kingdom. Euro Surveillance : Bulletin Europeen Sur les Maladies Transmissibles = European Communicable Disease Bulletin. 15, (2010).
- Wong, K., Fong, T. T., Bibby, K., Molina, M. Application of enteric viruses for fecal pollution source tracking in environmental waters. Environment International. 45, 151-164 (2012).
- Cashdollar, J. L., Wymer, L. Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies. Journal of Applied Microbiology. 115, 1-11 (2013).
- Ikner, L. A., Soto-Beltran, M., Bright, K. R. New method using a positively charged microporous filter and ultrafiltration for concentration of viruses from tap water. Applied and Environmental Microbiology. 77, 3500-3506 (2011).
- Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water. Applied and Environmental Microbiology. 75, 2393-2399 (2009).
- McMinn, B. R., Cashdollar, J. L., Grimm, A. C., Fout, G. S. Evaluation of the celite secondary concentration procedure and an alternate elution buffer for the recovery of enteric adenoviruses 40 and 41. Journal of Virological Methods. 179, 423-428 (2012).
- Katzenelson, E., Fattal, B., Hostovesky, T. Organic flocculation: an efficient second-step concentration method for the detection of viruses in tap water. Applied and Environmental Microbiology. 32, 638-639 (1976).
- Fout, G. S., Schaefer, F. W., Messer, J. W., Dahling, D. R. . ICR microbial laboratory manual. 178, (1996).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153, 79-83 (2008).
- Calgua, B., et al. Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas. Water Research. 47, 2797-2810 (2013).
- McMinn, B. R. Optimization of adenovirus 40 and 41 recovery from tap water using small disk filters. Journal of Virological Methods. 193 (2), 284-290 (2013).
- Brinkman, N. E., Haffler, T. D., Cashdollar, J. L., Rhodes, E. R. Evaluation of methods using celite to concentrate norovirus, adenovirus and enterovirus from wastewater. Journal of Virological Methods. 193, 140-146 (2013).
- Albinsson, B., Kidd, A. H. Adenovirus type 41 lacks an RGD alpha(v)-integrin binding motif on the penton base and undergoes delayed uptake in A549 cells. Virus Research. 64, 125-136 (1999).
- He, C., Lian, J. S., Jiang, Q. Electronic structures and hydrogen bond network of high-density and very high-density amorphous ices. The Journal of Physical Chemistry. B. 109, 19893-19896 (2005).
- Sedmak, G., Bina, D., Macdonald, J., Couillard, L. Nine-year study of the occurrence of culturable viruses in source water for two drinking water treatment plants and the influent and effluent of a Wastewater Treatment Plant in Milwaukee, Wisconsin. 71, 1042-1050 (2005).
- Soto-Beltran, M., Ikner, L. A., Bright, K. R. Effectiveness of poliovirus concentration and recovery from treated wastewater by two electropositive filter methods. Food and Environmental Virology. 5, 91-96 (2013).
- Haramoto, E., Katayama, H. Application of acidic elution to virus concentration using electropositive filters. Food and Environmental Virology. 5, 77-80 (2013).
- Lee, H., et al. Evaluation of electropositive filtration for recovering norovirus in water. Journal of Water and Health. 9, 27-36 (2011).
- Gibbons, C. D., Rodriguez, R. A., Tallon, L., Sobsey, M. D. Evaluation of positively charged alumina nanofibre cartridge filters for the primary concentration of noroviruses, adenoviruses and male-specific coliphages from seawater. Journal of Applied Microbiology. 109, 635-641 (2010).
- Hill, V. R., et al. Development of a rapid method for simultaneous recovery of diverse microbes in drinking water by ultrafiltration with sodium polyphosphate and surfactants. Applied and Environmental Microbiology. 71, 6878-6884 (2005).
- Polaczyk, A. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. Evaluation of 1MDS electropositive microfilters for simultaneous recovery of multiple microbe classes from tap water. Journal of Microbiological Methods. 68, 260-266 (2007).
- Rhodes, E. R., Hamilton, D. W., See, M. J., Wymer, L. Evaluation of hollow-fiber ultrafiltration primary concentration of pathogens and secondary concentration of viruses from water. Journal of Virological Methods. 176, 38-45 (2011).
- Melnick, J. L., et al. Round robin investigation of methods for the recovery of poliovirus from drinking water. Applied and Environmental Microbiology. 47, 144-150 (1984).
- Schwab, K. J., De Leon, R., Sobsey, M. D. Concentration and purification of beef extract mock eluates from water samples for the detection of enteroviruses, hepatitis A virus, and Norwalk virus by reverse transcription-PCR. Applied and Environmental Microbiology. 61, 531-537 (1995).
