Um protocolo para infectar<em> Caenorhabditis elegans</em> Com<em> Salmonella typhimurium</em
Summary
C. elegans tem emergido como um novo modelo genético para estudar as interações patógeno-hospedeiro. Aqui nós descrevemos um protocolo para infectar C. elegans com Salmonella typhimurium, juntamente com a técnica de interferência dupla vertente RNAi para examinar o papel dos genes do hospedeiro na defesa contra a infecção por Salmonella.
Abstract
Na última década, C. elegans tem emergido como um organismo de invertebrados para estudar interações entre hospedeiros e patógenos, incluindo a defesa do hospedeiro contra bactérias gram-negativas bactéria Salmonella typhimurium. Salmonella estabelece infecção persistente no intestino de C. elegans e resulta na morte prematura dos animais infectados. Um número de mecanismos de imunidade foram identificados em C. elegans para se defender contra infecções por Salmonella. Autophagy, uma via de degradação lisossomal evolutivamente conservadas, foi mostrado para limitar a replicação de Salmonella em C. elegans e nos mamíferos. Aqui, é descrito um protocolo para infectar C. elegans com Salmonella typhimurium, em que os vermes são expostos a Salmonella por um tempo limitado, semelhante à infecção por Salmonella em humanos. infecção por Salmonella encurta significativamente o tempo de vida de C. elegans </ Em>. Usando o gene essencial autofagia bec-1 como exemplo, que combinado este método de infecção com C. elegans ARNi alimentação abordagem e mostraram que este protocolo pode ser utilizado para examinar a função de C. genes do hospedeiro elegans em defesa contra a infecção por Salmonella. Desde C. elegans genoma bibliotecas inteiras RNAi estão disponíveis, este protocolo torna possível para a tela de forma abrangente para C. elegans genes que protegem contra Salmonella e outros patógenos intestinais usando bibliotecas RNAi genômicos.
Introduction
O solo de vida livre Caenorhabditis elegans nematóide é um organismo modelo simples e geneticamente tratável usada para estudar muitas questões biológicas. C. elegans dominantemente existe como hermafroditas auto-fertilização. Os machos são gerados de forma espontânea por não-disjunção do cromossomo X durante a gametogênese 1,2. Na presença de alimento abundante, C. elegans desenvolver continuamente através de quatro fases larval ao adulto. A temperatura também influencia C. desenvolvimento elegans; desenvolvimento mais rápido é observada a temperaturas mais elevadas. No laboratório, C. elegans é cultivada a uma temperatura normal de 20 ° C em placas de agar com semeado bactéria Escherichia coli (estirpe OP50) como alimento de 1,2.
Na última década, C. elegans tem emergido como um organismo de invertebrados para estudar as interações patógeno-hospedeiro 3-5. Na natureza, C. elegans come bactérias como nutrient 1,2 fonte. Sua comida laboratório bacteriana normal, OP50, pode ser facilmente substituído por outros agentes patogénicos para examinar as interações entre C. elegans e qualquer agente patogénico escolhido. Sob estas condições, o intestino é o principal local da infecção. De facto, uma grande variedade de agentes patogénicos bacterianos tem sido mostrado para infectar letalmente C. elegans 3-5.
A bactéria Salmonella gram-negativo é um patógeno gastrointestinal que causa doenças de origem alimentar humana em todo o mundo 6,7. C. elegans é um bom anfitrião modelo para Salmonella typhimurium como esta bactéria replica e apresenta infecções intestinais persistentes 8-10. C. elegans foi utilizado para identificar novas e anteriormente conhecida virulência de Salmonella factores 11. Curiosamente, a C. sistema imunitário elegans limita com sucesso a replicação de Salmonella. Foi relatado anteriormente que inibidoition de genes autofagia torna o aumento da replicação Salmonella em C. elegans, resultando em morte precoce de vermes infectados 10. Macroautofagia (aqui referido como autofagia) é um processo dinâmico, que envolve o rearranjo de membranas intracelulares para sequestrar citoplasma e organelas para entrega do lisossoma para degradação 12. Autophagy foi reportado para limitar a replicação de Salmonella em C. elegans e em mamíferos 10,13.
O C. elegans genoma foi o primeiro genoma eucarionte multicelular seqüenciado; ele é sensível ao tratamento 14-16 RNAi. Além disso, o RNAi pode ser administrado de forma eficaz, sujeitando vermes ingerir bactérias contendo o ARN de cadeia dupla do gene alvo, conhecido como RNAi alimentação 16,17. Genoma bibliotecas inteiras de alimentação RNAi foram gerados por RNAi do genoma triagem 16,18. Nisto, uma infecção pro Salmonellatocolo está acoplado com o RNAi alimentação para permitir o teste C. elegans genes de interesse para a sua capacidade de proteger contra infecção por Salmonella.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. elegans é um simples organismo modelo genético que se alimenta de bactérias como fonte de nutrientes. Assim, é fácil de substituir a sua comida bacteriana normal com um patógeno intestinal para investigar as interações entre C. elegans e o agente patogénico escolhido. Nisto um protocolo é descrito combinar infecção por Salmonella e C. elegans RNAi alimentando tratamento para examinar o papel dos genes do hospedeiro na defesa contra a infecção por Salmonella. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Diane Baronas-Lowell para a leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado por uma FAU Charles E. Schmidt Faculdade de Ciências Grant Semente e uma bolsa Envelhecimento da Fundação Médica Ellison para KJ
Materials
| LB Broth | Fisher | BP9723-500 | |
| XLD agar | EMD Chemicals | 1.05287.0500 | |
| Bacto Agar | Fisher | DF0140-01-0 | |
| Peptone | Fisher | BP1420-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | S671-500 | |
| Calcium Chloride | Fisher | C69-500 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M65-500 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | 12481C50 | |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | |
| Ampicillin | Fisher | BP1760-25 | |
| Salmonella typhimurium | ATCC | ATCC14028 | |
| Petri Dish 95 x 15mm | Fisher | FB0875714G | |
| Petri Dish 60 x 15mm | Fisher | 08-757-13A | |
| Falcon Serological pipet | Fisher | 13-668-2 | |
| Falcon Express Pipet-Aid | Fisher | 13-675-42 | |
| MaxQ6000 shaking incubator | Thermo Scientific | SHKE6000-7 | |
| Incubator | Percival | I-36DL |
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