Роман микродиссекция подход к Восстановление<em> Микобактерии туберкулеза</em> Конкретные Стенограммы из фиксированных формалином и залитые парафином легких гранулемы
Summary
Микродиссекция была широко используется для проведения экспертизы ДНК, РНК и белка в ткани. Лазерная захвата микроскопии (НОК) является наиболее часто используемым методом, но новая техника фрезерные, mesodissection, является недавно доступны. Мы демонстрируем выделения РНК из mesodissected формалина фиксированной парафин тканей горки микобактерий туберкулеза гранулемы.
Abstract
Микродиссекция был использован для изучения тканей на ДНК, РНК и белка уровнях уже более десяти лет. Лазерная захвата микроскопии (НОК) является метод наиболее распространенным микродиссекции используется и сегодня. В этой технике, лазер используется для фокально расплава термопластичный мембраны, которое закрывает секцию обезвоженную ткань 1. Срез ткани композит затем поднимается и отделен от мембраны. Хотя этот метод может быть успешно использован для ткани экспертизы, это занимает много времени и дорого. Кроме того, успешное завершение процедур с использованием этой техники требует использования лазера, что ограничивает его применение. Новый, более доступным и практичным микродиссекции подход называется mesodissection является возможным решением для ловушек LCM. Эта техника использует систему MESO-1/MeSectr фрезеровать нужный ткань от слайд установлен образца ткани при одновременном дозирования и аспирации жидкости с целью выделения нужного образца ткани врасходным мельница немного. Перед началом процесса вскрытия, пользователь выравнивает фиксированных формалином парафин (FFPE) скользить с гематоксилином и эозином окрашенных (H & E) ссылка слайд. После этого, оператор комментирует нужную область рассечение и приступает к препарировать соответствующий сегмент. Программа генерирует архивный образ вскрытия. Главное преимущество mesodissection является короткая продолжительность необходимости препарировать слайд, принимая в среднем десять минут от настройки, чтобы пробовать поколение в этом эксперименте. Кроме того, система значительно более экономически эффективным и удобным для пользователя. Небольшое неудобство в том, что это не так точен, как лазерная захвата микроскопии. В этой статье мы показали, как mesodissection может быть использован для получения РНК из слайдов из FFPE гранулем, вызванных микобактериями туберкулеза (МТБ).
Introduction
Образцы традиционно вручную микродиссекции либо из всей ткани или слайдов с помощью иглы и скальпеля. Это требует четкого разделения между среза ткани интереса и окружающих тканей разделах 2. При нынешних достижений в области технологий молекулярной профилирования, наблюдается растущая потребность для оценки ткани на клеточном уровне. В связи с ограничениями ручной микродиссекции, методов, включая LCM были созданы, чтобы позволить большую точность изоляции. Этот метод позволяет исследователю выделить отдельные клеточные популяции из различных типов клеток и скольжения, которые затем могут быть использованы для последующих анализов, таких как экспрессии генов профилирования. Хотя очень эффективным для последующих анализов, НОК не без ограничений. Во-первых, НОК является дорогим и трудоемким процессом. Кроме того, из-за нестабильного характера РНК, часто вызов, чтобы получить высокое качество РНК из образцов LCM 2. В связи с диsadvantages из LCM, новые достижения в микродиссекции технологии по-прежнему необходимы, чтобы сделать его более доступным для большего числа исследователей в доступной и срочной основе.
Одним из таких продвижение в микродиссекции технологии теперь доступны является метод, известный как mesodissection. В этой технике машина используется для мельницы разделе аннотированный ткани интерес и всасывает ее в расходных мельницы бит 3. Затем этот образец может быть атмосферный в пробирку и используется для последующих применений. Преимущества этой системы в том, что это значительно дешевле и чувствительным временем. По нашему опыту, система позволяет вскрытие участка ткани легких гранулемы в десять минут. С другой стороны, традиционные НОК, вероятно, потребует часов, чтобы завершить процесс. Система позволяет оператору загружать эталонный слайд использовать в качестве сравнения, а также инструмент для аннотации. Кроме того создается отчет с изложением тыс.э область слайда, который был расчлененный. Есть две основные недостатки в mesodissection. Хотя эффективны при извлечении несколько ячеек, это сложно выделить одну ячейку. Кроме того, точность изображение, формируемое не ясно, как при использовании других микроскопов визуализации.
Туберкулез (ТБ) является одним из основных инфекционное заболевание убийца человечества во всем мире и является результатом заражения MTB. В большинстве человека в результате воздействия аэрозолей Mtb, инфекция латентно ограничивается. По крайней мере в 10 миллионов человек в год, это приводит к активной формой туберкулеза 4. Во время латентной инфекции, Mtb содержится в патологических поражения легких, известных как гранулемы. Поэтому было высказано мнение, что исход Mtb инфекции на уровне гранулемы 5 решили.
Здесь показано, как mesodissection могут быть использованы для microdissect гранулемы, вызванные MTB. Слайды, используемыевзяты из FFPE легочной ткани от зараженных макак-резусов. Для этой демонстрации, мы будем рассекать гранулемы во всей их полноте. Мы также показали, что РНК может быть получена из восстановленной ткани. Этот метод может быть применен для образцов ткани из различных других образцов, а затем используется для различных последующих анализов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mesodissection является метод, который может быть применен к экстракции РНК из патологических слайдов поражения, вызванные широкий спектр патогенных микроорганизмов. Это необходимость, чтобы пользователь отслеживает изображение и выравнивает изображение правильно. Чтобы достичь этого, пр?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить следующих NIH награды / subawards за поддержку данного исследования: R01HL106790, R01HL106790-S1, R01HL106786, R01AI089323, R21AI091457, R21RR026006, P20RR020159, C06RR017563, 8T32OD011124-08, и P51OD011104.
Materials
| MeSectr | AvanSci Bio | Mesodissector | |
| 400 nm xScisors | AvanSci Bio | Other sizes available | |
| THOR | AvanSci Bio | Programmable Heater-Shaker | |
| NanoDrop2000 | ThermoScientific | ND-2000 | |
| RNeasy FFPE extraction kit | Qiagen | 73504 | |
| Ovation RNA-Seq FFPE System | Nugen | 7150 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 |
References
- Fend., F., Raffeld, M. Laser capture microdissection in pathology. J Clin Pathol. 53(9):666-72. (2000).
- Esposito, G. Complementary techniques: laser capture microdissection–increasing specificity of gene expression profiling of cancer specimens. Adv Exp Med Biol. 593:54-65. doi: 10.1007/978-0-387-39978-2_6. (2007).
- Adey, N., Bosh, D., Emery, D., Birch, L., Parry, R. Mesodissection of Paraffin Embedded Slide Mounted Tissue Sections. Journal of Molecular Diagnostics. 14(6):745-. (2012).
- Fleischmann, R.D., Alland, D., Eisen, J.A., Carpenter, L., White, O., Peterson, J., et al. Whole-genome comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical and laboratory strains. J Bacteriol. 184(19):5479-90. (2002).
- Russell, D.G., Barry 3rd, C.E., Flynn, J.L. Tuberculosis: what we don’t know can, and does, hurt us. Science. 328(5980):852-6. doi: 10.1126/science.1184784. (2010).
- AvanSciBio. Mesodissection of fibrous tissue. <http://avansci-bio.com/uploads/CDP-15_Mesodissection_of_Fibrous_Tissue_Rev_B.pdf> (2013).
- Paige, C., Bishai, W.R. Penitentiary or penthouse condo: the tuberculous granuloma from the microbe’s point of view. Cell Microbiol. 12(3):301-9. Epub 2009/12/31. doi: 10.1111/j.1462-5822.2009.01424.x. PubMed PMID: 20039878 (2010).
- Mehra, S., Alvarez, X., Didier, P.J., Doyle, L.A., Blanchard, J.L., Lackner, A.A., et al. Granuloma correlates of protection against tuberculosis and mechanisms of immune modulation by Mycobacterium tuberculosis. J Infect Dis. 207(7):1115-27. doi: 10.1093/infdis/jis778. (2013).
- Kaushal, D., Schroeder, B.G., Tyagi, S., Yoshimatsu, T., Scott, C., Ko, C., et al. Reduced immunopathology and mortality despite tissue persistence in a Mycobacterium tuberculosis mutant lacking alternative sigma factor, SigH. Proc Natl Acad Sci U S A. 99(12):8330-5. doi: 10.1073/pnas.102055799. (2002).
- Mehra, S., Kaushal, D. Functional genomics reveals extended roles of the Mycobacterium tuberculosis stress response factor sigmaH. J Bacteriol. 191(12):3965-80. doi: 10.1128/JB.00064-09. (2009).
- Rohde, K.H., Veiga, D.F., Caldwell, S., Balazsi, G., Russell, D.G. Linking the transcriptional profiles and the physiological states of Mycobacterium tuberculosis during an extended intracellular infection. PLoS Pathog. 8(6):e1002769. doi: 10.1371/journal.ppat.1002769. (2012).
- Fontan, P.A., Voskuil, M.I., Gomez, M., Tan, D., Pardini, M., Manganelli, R., et al. The Mycobacterium tuberculosis sigma factor sigmaB is required for full response to cell envelope stress and hypoxia in vitro, but it is dispensable for in vivo growth. J Bacteriol. 191(18):5628-33. doi: 10.1128/JB.00510-09. (2009).
- Rustad, T.R., Harrell, M.I., Liao, R., Sherman, D.R. The enduring hypoxic response of Mycobacterium tuberculosis. PLoS One. 3(1):e1502. doi: 10.1371/journal.pone.0001502. (2008).
