تقييم نشاط مضاد للفطريات المعزولة من السنخية الضامة التي كتبها متحد البؤر المجهري
Summary
وهناك طريقة لتقييم قدرة معزولة الضامة السنخية الماوس للسيطرة على نمو الجراثيم المبتلعة من قبل الرشاشيات المجهري متحد البؤر.
Abstract
الرئة هو واجهة حيث تتعرض الخلايا المضيفة بشكل روتيني للميكروبات والمنتجات الميكروبية. الضامة السنخية هي الخلايا البلعمية الخط الأول التي تواجه الفطريات والميكروبات الأخرى المستنشق. الضامة والخلايا المناعية الأخرى تعترف الزخارف الرشاشيات بواسطة مستقبلات الاعتراف الممرض والشروع في الاستجابات الالتهابية المصب. أوكسيديز NADPH بلعمية يولد سيطة الاكسجين التفاعلية (رويس) وهذا أمر مهم للدفاع المضيف. على الرغم من NADPH أوكسيديز هو أمر حاسم لبوساطة العدلات دفاع المضيف 1-3، ليست محددة جيدا أهمية NADPH أوكسيديز في الضامة. وكان الهدف من هذه الدراسة لتحديد دور محدد من NADPH أوكسيديز في الضامة في التوسط الدفاع المضيف ضد A. فوميجاتوس. وجدنا أن أوكسيديز NADPH في الضامة السنخية تسيطر على نمو المبتلعة A. فوميجاتوس جراثيم 4. هنا، نحن تصف طريقة لتقييم قدرة الفأرالضامة lveolar (AMS) للسيطرة على نمو الجراثيم المبتلعة الرشاشيات (غبيرات). هي ملطخة الضامة السنخية في الجسم الحي وعزل بعد عشرة أيام من الفئران عن طريق غسل القصبات (BAL). ومطلي الضامة على coverslips الزجاج، ثم المصنف مع بروتين الفلورية الخضراء (GFP)، معربا عن A. جراثيم فوميجاتوس. في أوقات محددة، يتم إصلاح الخلايا ويتم تقييم عدد الضامة سليمة مع الجراثيم المبتلعة بواسطة المجهر متحد البؤر.
Introduction
الضامة السنخية هي الخلايا البلعمية الخط الأول التي تواجه الميكروبات المستنشق. الضامة الاعتراف الزخارف الرشاشيات بواسطة مستقبلات الاعتراف الممرض، واستيعاب الحد من نمو الجراثيم استنشاقه (غبيرات)، والشروع في الاستجابات الالتهابية. أوكسيديز NADPH بلعمية يحول الأكسجين الجزيئي لأنيون الفائق والمصب سيطة الاكسجين التفاعلية (رويس). الداء الحبيبي المزمن (CGD) هو اضطراب وراثي من أوكسيديز NADPH تتميز الالتهابات البكتيرية والفطرية الشديدة والاستجابات الالتهابية المفرطة.
على الرغم من NADPH أوكسيديز هو أمر حاسم لبوساطة العدلات دفاع المضيف 1-3، ليست محددة جيدا أهمية NADPH أوكسيديز في الضامة. وقد أظهرت دراسات سابقة أن الضامة السنخية استيعاب وقتل الجراثيم الرشاشيات، في حين تستهدف أساسا العدلات المرحلة خوطي 5. ومع ذلك، فقد كان هناك تضارب بالنتيجهنهاية الخبر لدور أوكسيديز NADPH في البلاعم في السيطرة على نمو A. فوميجاتوس جراثيم 6، 7.
وكان الهدف من هذا الأسلوب لتحديد دور محدد من NADPH أوكسيديز في الضامة في التوسط الدفاع المضيف ضد A. جراثيم فوميجاتوس. وجدنا أن أوكسيديز NADPH في الضامة السنخية تسيطر على نمو المبتلعة A. فوميجاتوس جراثيم 4. لنمذجة الأكثر تطابقا استجابة المضيف لاستنشاق الفطريات، استخدمنا الضامة السنخية المقطوع من قبل غسل الشعبى من الفئران unstimulated التالية التضحية فورا. استخدام الضامة السنخية معزولة مكنتنا من التركيز على نشاطهم مضاد للفطريات في غياب الخلايا المناعية الأخرى (على سبيل المثال، العدلات المعينين) التي تدافع ضد الرشاشيات في الجسم الحي. في هذه الطريقة، كانت ملطخة الضامة السنخية في الجسم الحي قبل الحصاد وذلك لتقليل كمية من التلاعب في مرحلة ما بعد الحصاد. </ ع>
ميزة أخرى لهذا البروتوكول هو استخدام، معربا عن GFP A. فوميجاتوس السلالة. هذه الفطريات عن GFP من مرحلة غبيري خلال المرحلة خوطي وليس لديها الحاجة إلى مزيد من تلطيخ. للحصول على صور مع بمزيد من التفصيل، اخترنا المجهري متحد البؤر والتي تمكن إعادة بناء هياكل ثلاثية الأبعاد من الصور التي تم الحصول عليها. إعادة البناء ثلاثي الأبعاد يعطي القدرة على التفريق بين خيوط متنامية في جميع أنحاء بدلا من أو من خلال البلاعم. غبيرات يمكن أيضا أن تكون متميزة تماما كما داخل الخلايا مقابل خارج الخلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
استخدام هذا النهج لالسابقين فيفو تحليل نشاط مضاد الضامة في الجسم الحي جنبا إلى جنب مع الفطرية التحدي، أثبتنا سابقا أن أوكسيديز NADPH في الضامة تلعب دورا هاما في الدفاع ضد A. فوميجاتوس 4. استخدام الضامة السنخية معزولة يتيح لنا التركيز على نشاطهم مضاد …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية منحة R01AI079253 (لBHS)، والمعهد الوطني للسرطان مركز سرطان دعم المنح CA016056 لمعهد روزويل بارك للسرطان.
Materials
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma | PKH26GL-1KT | |
| 2,2,2 Tribromoethanol | Sigma | T48402 | Used to make AvertinAnesthetic |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma | A-1685 | Used to make AvertinAnesthetic |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium) | Corning | 21-031-CV | |
| NH4CL | Sigma | A0171 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
| KHCO3 | Sigma | P91444 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
| EDTA | Sigma | E6758 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
| 22 gauge X 1.00 inch i.v. catheter | BD | 381523 | Insyte Autoguard Winged |
| insulin syringes | |||
| 6 ml syringes | |||
| 4-way stopcock | Fisher Scientific | 50-700-077 | |
| suture thread | |||
| 50 ml conical centrifuge tubes | |||
| gauze sponges (4 inch square) | |||
| RPMI 1640 with L-glutamine | Corning | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | heat inactivated |
| Hema 3 Stain Set | Fisher Scientific | 22-122-911 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | |
| Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants | BD | 297252 | |
| Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein | provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada | ||
| 100 micron Cell Strainers | BD Falcon | 64753-00 | |
| scissors | |||
| forceps | |||
| Biological Safety Cabinet Class II | |||
| Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor | |||
| Leica DM1000 light microscope | |||
| Hemocytometer | |||
| Cytospin 2 centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Cell Culture Incubator | 37 °C, 5% CO2 | ||
| 22X22 mm micro cover glass | VWR | 48366-227 | glass coverslips |
| 6 well Cell Culture Plates | Corning | 3506 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | BDH0502-1LP | |
| Vectashield Mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Leica TCS SP2 system with a laser point scanner | Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope |
References
- Reeves, E. P., et al. Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux. Nature. 416, 291-297 (2002).
- Bianchi, M., et al. Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis. Blood. 114, 2619-2622 (2009).
- Vethanayagam, R. R., et al. Role of NADPH oxidase versus neutrophil proteases in antimicrobial host defense. PLoS One. 6, (2011).
- Grimm, M. J., et al. Monocyte- and Macrophage-Targeted NADPH Oxidase Mediates Antifungal Host Defense and Regulation of Acute Inflammation in Mice. The Journal of Immunology. 190, 4175-4184 (2013).
- Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes. J Clin Invest. 69, 617-631 (1982).
- Philippe, B., et al. Killing of Aspergillus fumigatus by alveolar macrophages is mediated by reactive oxidant intermediates. Infect Immun. 71, 3034-3042 (2003).
- Cornish, E. J., et al. Reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase-independent resistance to Aspergillus fumigatus in alveolar macrophages. J Immunol. 180, 6854-6867 (2008).
- Jennings, J. H., Linderman, D. J., Hu, B., Sonstein, J., Curtis, J. L. Monocytes recruited to the lungs of mice during immune inflammation ingest apoptotic cells poorly. Am J Respir Cell Mol Biol. 32, 108-117 (2005).
- Davidson, B. A., et al. DISCRIMINATION OF RESIDENT AND INFILTRATED ALVEOLAR MACROPHAGES BY FLOW CYTOMETRY IN INFLUENZA A VIRUS-INFECTED MICE. Experimental Lung Research. 31, 323-339 (2005).
- Gelderman, K. A., et al. Macrophages suppress T cell responses and arthritis development in mice by producing reactive oxygen species. J Clin Invest. 117, 3020-3028 (2007).
- Pizzolla, A., et al. Reactive oxygen species produced by the NADPH oxidase 2 complex in monocytes protect mice from bacterial infections. J Immunol. 188, 5003-5011 (2012).
- Luther, K., et al. Characterisation of the phagocytic uptake of Aspergillus fumigatus conidia by macrophages. Microbes and Infection. 10, 175-184 (2008).
- Geunes-Boyer, S., et al. Surfactant Protein D Increases Phagocytosis of Hypocapsular Cryptococcus neoformans by Murine Macrophages and Enhances Fungal Survival. Infection and Immunity. 77, 2783-2794 (2009).
- García-Rodas, R., González-Camacho, F., Rodríguez-Tudela, J. L., Cuenca-Estrella, M., Zaragoza, O. The Interaction between Candida krusei and Murine Macrophages Results in Multiple Outcomes, Including Intracellular Survival and Escape from Killing. Infection and Immunity. 79, 2136-2144 (2011).
- Ryan, L. K., Vermeulen, M. W. Alveolar macrophages from C3H/HeJ mice show sensitivity to endotoxin. Am J Respir Cell Mol Biol. 12, 540-546 (1995).
- Redente, E. F., et al. Differential polarization of alveolar macrophages and bone marrow-derived monocytes following chemically and pathogen-induced chronic lung inflammation. J Leukoc Biol. 88, 159-168 (2010).
- Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. I., Davis, C. E. Killing of Aspergillus spores depends on the anatomical source of the macrophage. Infect Immun. 42, 1109-1115 (1983).
- Goodridge, H. S., et al. Differential use of CARD9 by dectin-1 in macrophages and dendritic cells. J Immunol. 182, 1146-1154 (2009).
