복셀에서 지식 : 복잡한 전자 현미경 3D-데이터의 분할에 대한 실용 가이드

그림 1은 전자 단층 촬영, FIB-SEM 및 SBF-SEM을 포함하여 3 차원 전자 현미경 세포 이미징을위한 일반적인 워크 플로를 보여줍니다. 워크 플로우는 선택한 분할 소프트웨어의 효율성을 최대화하기 위해 관심 영역 자르기, 원시 데이터 수집, 3D 볼륨에 데이터를 정렬하고 재구성, 필터링을 통해 노이즈 감소, 및 필요한 경우를 포함한다. 이러한 전처리 된 데이터는 특징 추출 / 분할을위한 다음 준비가되어 있습니다. 그림 2는 다른 두 FIB에 따른와 전자 단층 촬영 (그림 2A, 2B)에 의해 기록 된 수지 샘플이 내장 된 아르이있는 (아래에 더 소개합니다) 네 개의 다른 데이터 세트와 함께 그림 1에서 규정 된 워크 플로우를 보여줍니다 각각 -SEM 및 SBF-SEM, (그림 2C, 2D). 그림 2 열 1에서 이미지 투사 있습니다정렬 및 재건에 3D 볼륨으로 조립보기 각각 (그림 2A1, 2B1) 및 블록 표면 이미지 (그림 2C1, 2D1). 열이 필터링 (3 열)에 소음에 상당한 감소를 보여, 따라서 종종 더 선명 표시 등 3D 볼륨을 통해 조각을 보여줍니다. (칼럼 4)을 선택하고 관심 영역에 큰 볼륨을 3D 자르기 후이자 (컬럼 5)의 분할 기능 3D 렌더링은 정량적 분석 수득 또한 검사, 색 코딩 될 수있다. 여섯 3D 데이터 세트의 전체는, 어느 전자 단층 촬영 (3 데이터 세트)를 통해 얻어진 화상의 스택을 포함하고 각각은 FIB-SEM (2 데이터 세트), 또는 SBF-SEM (1 데이터 세트)의 방법을 각각 비교하는 데 사용 네 분할 방법 (그림 3)을 수행합니다. 데이터 세트는 실험실에서 다양한 연구 프로젝트의 다양한 줄기 때문에 아칸소 제공전형적인 실험 데이터 세트의 easonably 다양한 설정합니다. 모든 데이터 세트가 하나의 특정 접근법 가장 익숙한 이들 중 각각 4 개의 독립적 인 연구에 의해 조사 하였다, 이들은 여섯 각 데이터 셋에 대해 최상의 결과를 제공하는 충전 하였다. 다음과 같이 데이터 세트 샘플에서 아르 : 1도 3A1-3A5 : 고압 냉동, 치환 동결 및 수지 포함 된 병아리 내이 머리 세포 stereocilia 31, 2도 3B1-3B5 : 고압 냉동, 동결 , 치환 및 수지 포함 된 식물 세포 벽 (미 출판) 3도 3C1-3C5 : 고압 냉동, 동결 치환 및 수지 임베디드 내이 머리 세포 kinocilium (미 출판) 4 그림 3D1-3D5 : 높은 압력 – 냉동, 동결 치환 인간의 유선 상피 세포 라미닌 풍부한 extracell에서 배양 된 HMT-​​3522 S1 꽈리에있는 미토콘드리아의 수지 임베디드 블록신경근 매트릭스 32, 33, 5도 3E1-3E5 : 흠 탁상용 가공, 황산 감속기 세균 생물막의 수지 매립 블록 (제조에서 원고), 및 6도 3F1-3F5 : HMT의 인접 셀들의 경계 막 -3522 S1의 꽈리. 도 3에서 알 수있는 바와 같이, 다른 분할 방법은 다른 데이터 유형에 대한 일부 데이터 집합 타입에 거의 유사한 결과이지만 전혀 다른 결과가 발생할 수있다. 예를 들어, 머리 셀 stereocilia 데이터 세트 (도 3a)을 해석하고 측정하기 위해 깨끗한 인 전문가가 사용자에 의해 생성 설명서 추상화 모델 네 합리적인 접근법 세그멘테이션 볼륨을 산출한다. 이 경우, 이러한 모델은 대응 밀도 맵의 누락 부분의 긴 필라멘트 사이에서 발견 링크의 수뿐만 아니라 결정 계수, 필라멘트 필라멘트 거리의 빠른 측정을 허용시편은 샘플 준비 34시 손상 위치에. 이러한 정보는 커스텀 메이드 자동 세그멘테이션 순수 농도 – 기반 임계 값보다 더 나은 결과를 제공하지만, 다른 세 세그멘테이션 방법을 이용하여 획득하는 것이 훨씬 더 곤란하다. 식물 세포벽 (도 3b)의 경우, 수동 모델 생성은 다른 접근 방식 중 어느 것도 달성하지 세포벽에 순서의 의미를 전달에 가장 효율적인 것으로 나타났다. 그러나, 추상화 모델은 데이터 세트의 오브젝트의 혼잡을 캡처하지 않는다. 수동으로 관심의 기능을 추적하는 것은 밀도 기반 또는 형상 감독 방법보다 더 나은 결과를 제공 할 것으로 보인다. 한편, 서, 추적은 매우 노동 집약적이며, 특징의 식별 테두리 다소 주관적이다. 따라서, 자동화 된 접근 방법은 정밀도와 간의 트레이드 오프 전위로 대량 분할하기 위해 바람직 할 수있다자원은 수동 분할에 보냈다. kinocilium 데이터 세트 (도 3c)의 경우, 수동 추상화 모델 생성은 깨끗한 결과를 산출하고 kinocilium, 잘라낸 데이터에서 쉽게 볼 수있는 내용의 중심 세 미세 소관의 예기치 않은 구조를 보여준다 있지만, 모든 다른 접근법에서 분실 , 이질성 얼룩이 아마도 때문에. 그러나 밀도 맵의 기타 잠재적으로 중요한 기능은 추상 모델의 수동 생성에 누락되어 있습니다. 이는 수동 모델 형성의 주관적 자연 이상화 관찰 실제 밀도의 추상화에 이르게되므로 모델 형성시 주관적 해석한다는 사실이다. 따라서,이 예에서는 멋지게 추상화 모델을 생성 한 3D 볼륨의 특정 양태에 집중할 수있게하는 방법을 보여주는 설명서. 그러나, 선택적 지각과 단순화 모든 단백질의 공동의 전체 계좌를 제공하는 데 실패데이터 세트에 존재 mplexes. 목적은 데이터의 복잡성을 표시하는 경우, 따라서, 다음 하나 더 다른 세 가지 방법 중 하나로 제공된다. 3D 행렬 배양 유선의 꽈리 (도 3d)의 경우에, 높은 콘트라스트 미토콘드리아 너무 놀랍게도 오염의 최저 량으로 최상의 결과를 산출하지 기능 설명서 추적 (함께 쉽게 네 방식으로 분단된다 그림 3D3). 그러나 수동 추적은 매우 노동 집약적이고 많은 양에 따라서 사용이 제한됩니다. 정리를위한 더 트릭을 사용하는 경우 밀도가 임계 값 기반 및 형상 감독 자동화 분할 둘 다 아주 잘 미토콘드리아를 추출하고, 완벽에 가까운 세분화 될 것이다 (예를 들어, 복셀 밀도의 특정 임계 값 아래에있는 모든 개체를 제거)를 사용할 수 등을 다른 패키지. 이 경우, 수동 추상화 모델 구축은 수득되지 않았다일부 유망한 결과, 미토콘드리아 쉽게 공 및 스틱 모델에 근사 할 수 있기 때문이다. 박테리아의 토양 커뮤니티 / 바이오 필름 ​​(그림 3E)에 대해 사 방식의 세 가지 수동 모델 생성으로 인해 기하학적 모양으로 박테리아 같은 생물학적 개체를 나타내는의 도전에 실적이와 함께, 합리적인 결과를 얻을 수 있습니다. 박테리아 유래 세포 외 부속물이 아닌 아니라 수동 추적 기능의 자동 세그멘테이션 방법으로 검출 할 수있다. 형상 감독 커스텀 메이드 자동 세그멘테이션 더에도 매우 큰 데이터 세트를 쉽게 정량화를 허용 (데이터는 도시되지 않음)에도 불구하고 그들의 밀도 유사한 박테리아 세포 기능을 분리 할 수​​있다. 이것은 원래 매우 큰 데이터 세트이므로, 커스텀 메이드 자동 분할해도 다른 모든 접근법 outcompeted하지만 낮은 복잡도 혜택 수도관심 물체의 비교적 드문 드문 분포 (낮은 혼잡). 조직 형상 문맥 (도 3F)이 진핵 세포에서의 계면을 조사 할 때, 관심있는 특징 만 설명서 추적은 좋은 결과를 생성. 자동 밀도 계 분할 접근법은 모두 인접하는 셀 사이의 막 경계를 검출하는 데 실패하고, 전지의 형상은 쉽게 근사 또는 도형과 동등하지 않기 때문에 심지어 커스텀 메이드 접근법 박테리아에 대한 명확한 성공에도 불구하고, 부분적으로 실패 생물막에서 (그림 3E5). 세그먼트 화 접근법은 일부 데이터 세트에 있지만 다른 잘 수행하는 것이도 3에서 관찰은 이들 데이터 세트의 각각의 특징을 어떤 문제에지도, 및 데이터 특성이나 등장 개인 목표의 유형을 분류하는 것이 가능 여부 자신의 respectiv과 잘 일치전자 방식. 이 항목의 체계적인 연구는 이전에 수행되지 않은, 따라서 첫 번째 단계로서 화상의 특성 및 개인적인 목적 중 경험적리스트의 설정은 각 데이터 세트의 특징 추출을위한 최선의 방법을 찾을 수있는 그들의 시도 초보자 가이드있다. 상당한는도 4에 도시되는 8 개의 조건이 확인되었다, 그들은 두 개의 주요 카테고리로 나뉠 수있다 : (1) 데이터 세트에 내재하며, 기능 (2) 연구자의 ​​개인 목적 및 다른 고려 사항은 다소 있다고 주관적, 똑같이 중요한이기는하지만. 주로 세 개의 추가 데이터 세트가 도입되고 함께,도 3에 여섯 데이터 세트로부터 도출 제시된 예 : 하나 (도 4A1)는 애기 장대 식물 세포벽의 크라이 부의 크라이 단층이며, 제 (도 4A2 , 4B1, 4D1 </stroNG>)도 3F1-3F5에 도시 범주에 적합하지만, 더 실질적으로 복잡 할 수있는 고도로 복잡하고 복잡한 조직이다 내이 강선 vascularis의 FIB / SEM 데이터 세트, 및 제이다 (도 4B2 , 4D2)는 피규어 2A1-2A5 및 3A1-3A5에서 세로보기에 도시 샘플 컨텐츠 유사한 단면도에서 내이 머리 셀 stereocilia의 수지 – 부 단층이다. 화상의 특성, 추천 객관적인 기준의 범주에 대한 데이터 집합에 내재 사 특성이 중요한 것으로 제시된다 : 이러한 명확한 세포 기관 또는 다른 눈에 띄는 기능 서, 또는 (3) 높은과 휴대 풍경에서와 같이 (2) 중간 (그림 4A2)을 알아내는-EM 단층 촬영을위한 전형적인으로 데이터의 명암 (1) 저 (그림 4A1)이 될 수 있습니다 (도 4A3) kinoci위한 경우처럼z 방향 내에서 명확하게 분리 사상 요소의 배향에 의한 liary 단층 또는 단면 stereocilia. 데이터는 선명하게 정의 경계를 조직, 또는 선명 (그림 4B2)의 세포로이 가까운 곳에 객체 사이에 눈에 띄게 명확한 경계가 퍼지 (그림 4B1)이 될 수 있습니다. 이것은 부분적으로 약 2-4 FIB-SEM에 비해 전자의 단층 촬영을위한 계수에 의해 본질적으로 높은 데이터 세트 해상도의 함수이다. 물론, 선명한 경계는 후자의 방법 모두 수동뿐만 아니라 자동 분할 접근하는 것이 바람직하지만 필수적이다. 실질적으로 쉽게 이미지 분할을 자동화 렌더링 분리를 예시 콜로니에서 세균과 마찬가지로 밀도지도는 채워 띄엄 밀접 이격 식물 세포벽 성분에 의해 반사, 또는 어느 군집 (도 4C1) (도 4C2) 일 수있다. 밀도지도는 강선 vascularis 혈관 주위 조직 (그림 4D1) 또는 단면 stereocilia와 유사한 조직과 잘 정의 된 세포 기관과 같은 개체 (자주 불규칙한 모양과 매우 다른 기능을 가진 매우 복잡 할 수 있습니다 그림 4D2). 또한 비교가 다소 어렵게, 다른 모든 예에서 매우 다른 스케일을 확인합니다. 외에도 같은 적절한 경로의 선택을 안내 할 것입니다 화상의 특성, 네 매우 주관적 기준으로보다 객관적인 기준에서 또한 제안 : 원하는 목표 : 목적은 복잡성에 모발 다발 stereocilium 시각화 및 결정하고, 오브젝트 (도 4E1)의 형태를 검사하거나, 밀도 맵에 내장되어 단순하고 추상화 공 및 스틱 모델을 생성 할 수 있고, 수있는 빠른 계산기하학적 개체의 차 측정 (필라멘트의 길이, 거리, 연결 수) (그림 4E2). 이 기능 형태가 매우 불규칙하고 같은 액틴 필라멘트와 크로스로 주로 세포 – 세포 상호 작용 등의 미토콘드리아 (그림 4F2)와 같은 다소 유사하게 일부 변형 모양 영역 (그림 4F1), 또는 동일 모양으로 세포처럼 복잡 할 수 있습니다 세로 방향 (그림 4F3)의 머리 묶음에 링크되어 있습니다. 하나의 세그먼트로 3D 데이터 세트의 모든 기능을 할 수 있으므로 세포벽 (도 4G1), 또는 셀룰러 체적의 단지 작은 부분에 대한 경우와 같이 관심 (인구 밀도)의 형상의 비율이 중요 으로는 이종 세포 장면 (그림 4G2)에서 미토콘드리아의 경우입니다. 데이터 세트의 크기 및 분할을 요구 체적의 비율에 따라, 사용하는 것이 가장 효율적일 수있다수동적 인 접근 방법. 그러한 하나가 다양한 기능에 관심이있을 때와 같은 다른 경우에, 단지 반자동 분할 방식을 사용하는 다른 대안이 없다. 또 다른 주요 주관적 기준은 하나의 분할 과정에 투자 할 용의가 자원의 양 및 충실도 어떤 수준의 생물학적 질문에 대답해야합니다. 더주의를 정확한 정량적 정보 (도 4H,)를 구하는 데 필요한 수 있으며,이 경우 하나는, 원하는 (등 다른 기능의 크기, 용적, 표면적, 길이, 거리 등) 기능의 용적 파라미터를 정량화 할 수도 또는 목적은 단순히 자사의 3D 모양 (그림 4H2)의 사진을 스냅 할 수 있습니다. 자원이 제한이 이상적으로, 하나는 분명하게 타협이 아니라 사용자 지원 설명서 특징 추출의 가장 정확한 경로를 선택할 싶지 않을 것이다. 이 많은 데이터 세트에 대해 작동 할 수 있지만, 가까운 장래에 3D 볼륨을 줘야 리터는 10,000 이상으로 10K로 10K의 순서로, 수동 분할은 더 이상 같은 거대한 공간을 분할에 중요한 역할을 할 수 없습니다. 데이터 및 기타 데이터 특성의 복잡도에 따라, 반자동 분할 될 필요가있다. 그림 5에서, 장점과 한계는 간단히 네 분할 방법에 대해 나와 있습니다. 각 방법 페어링 할 수 있습니다 그림 4에서 확인 된 개인 목표와 화상의 특성도 설명되어 있습니다. 그림 6에서 개인 목적과 육 데이터 세트의 이미지 특성 데이터를 분류합니다 및 최선의 방법을 결정하는 방법을 예시. 모두 5와 6이 토론에 따라 확장되는 수치입니다. 로드 / 51673 / 51673fig1highres.jpg "폭 ="는 500px "/> 생물학적 영상 재구성 및 분석을위한 그림 1 워크 플로우.이 차트 단층 촬영에 의해 수집 된 다양한 수집하기 위해 촬영 단계 및 프로세스 이미지에 대한 개요를 제공, 이온 빔 SEM 및 일련 블록 얼굴 SEM을 집중했다. 2D 틸트 시리즈 또는 직렬 섹션에서 원시 데이터 수집 결과. 이러한 2D 이미지 세트는 다음 노이즈 감소 및 관심 피쳐의 콘트라스트를 향상시키기 위해 필터링, 3D 재구성으로 정렬되어야한다. 마지막으로, 데이터를 분할 할 수 있으며, 궁극적으로 3D 모델의 결과로 분석했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 2.. 단층 촬영 및 FIB-SEM 데이터 수집 후 워크 플로우의 각 단계에서 서로 다른 데이터 유형에 대한 워크 플로우의 예는 4 개의 데이터 세트 (행 AD)를 통해 표시되어 길이 방향으로 단면 stereocilia의 스테인드 단층 촬영 임베디드 수지, 수지는 식물 세포 벽의 스테인드 단층 촬영을 포함 E.의 셀룰로오스, 유방 상피 세포의 미토콘드리아 FIB-SEM 및 SBF-SEM 대장균 박테리아. 원시 데이터를 통해 2D 슬라이스가 컬럼 1에 도시되며, 정렬 및 3D 재구성 후의 데이터로부터 이미지를 따르고 2 열 3 열 적용 필터링 기술 단계는 메디안 필터 (A3)을, 비 등방성 확산 필터 (B3), 가우시안 블러 (C3) 및 MATLAB의 imadjust 필터 (D3). 이자 (4 열)의자를 영역에서 각 데이터 세트에 대한 최적의 분할의 예는 3D 열 5 스케일 바에서 렌더링으로 표시됩니다 : A1-A3 = 200 nm의, A4 = 150 nm의, A5 = 50 nm의, B1-B3 = 200 nm의 B4-B5 = 100 nm의, C1-C3 = 1mm, C4-C5가 = 500 nm의,D1-D3 = 2mm, D4-D5 = 200 nm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 사 분할의 그림 3 응용 프로그램은 예를 들어, 데이터 세트에 접근 식스 ​​예제 데이터 세트는 네 개의 방법으로 분단되었다 :. 수동 추상화 된 모델 생성, 수동 추적, 자동화 된 밀도 기반의 분할 및 커스텀 메이드 자동 분할. 정량적 목적을 위해 모델을 생성하는 것이 아니라 밀도를 추출하는 것이었다 수동으로 추상화 모델 생성은 stereocilia (A)의 단층 스테인드 매립 수지에 효과적이었다. 수지 식물 세포벽 (B), 자동 밀도 계 segmenta 스테인드 단층을 포함기 빠르게 수동 방법은 데이터의 단지 몇 조각에 더 많은 노력을했다 많은 슬라이스를 통해 셀룰로오스를 추출하는 가장 효과적인 방법이었다. 다른 분할 방법하지 않았다 동안 수동 추상화 된 모델 생성은 kinocilium (C)의 스테인드 단층 촬영에서 미세 소관 삼중 생성, 아직이 자동화 된 접근 방법이 더 빨리 밀도를 추출하기 때문에 선호 하였다. 인해 유방 상피 세포의 FIB-SEM (D)에서 미토콘드리아의 형상에 수동 추적 깨끗한 결과 및 신속한 분할 허용 보간 방법의 사용과 결합 된 낮은 인구 밀도를 제공했다. 분할 될하는 데 필요한 많은 양을 감안할 때, 커스텀 메이드 자동 분할은 SBF-SEM 박테리아 데이터 (E), 그러나 모두 자동 방식은 차이가 없었다 세그먼트에 가장 효율적인 것으로 판명. 많은 시간이 소요되지만, 유방 상피 세포막의 FIB-SEM (F)의 압축을 풀 수있는 유일한 방법은 수동 추적했다 스케일 바. :A1-A5 = 100 nm의, B1-B5 = 100 nm의, C1-C5 = 50 nm의, D1-D5 = 500 nm의, E1-E5 = 200 nm의, F1-F5, 바 = 500 nm의. 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 큰 버전. 그림 4 목표 이미지의 특성과 데이터 세트의 선별에 대한 주관적인 개인의 목표. 데이터의 예를 사용하여이 기준은 분할 방식을 사용하기로 결정을 알리기 위해 제안, 특성을 설정합니다. 객관적 특성과 관련하여, 데이터가 본질적으로 낮음, 중간, 높음 (A1-A3), 흐리거나 선명 (B1-B2)이 될 것입니다 대비를 가질 수 밖으로 간격 또는 (C1-C2) 혼잡하고 복잡하거나 단순히이 조직 기능 (D1-D2). 주관적 개인 목적은 원하는 O를 포함 bjective 관심 피쳐의 높거나 낮은 인구 밀도를 선택하여, 관심 (F1-F3)의 기능과 같은 복잡한 시트, 뒤얽힌 볼륨, 선형 형태를 식별하여 정확한 밀도 (E1-E2)을 단순화 된 모델을 대상으로하거나 추출 (G1-G2) 및 시간 (H1-H2) 스케일 바 등의 투자에 점감 반환을위한 고성능 및 높은 자원 할당 사이의 거래 (trade-off)에 따라 결정 :. A1 = 50 nm의, A2 = 1,500 nm의 , A3 = 100 nm의, B1 = 1500 nm의, B2 = 200 nm의, C1 = 100 nm의, C2 = 200 nm의, D1 = 10mm, D2 = 200 나노 미터, 100 나노 미터 = E1, E2 = 50 nm의, F1-F2 = 500 nm의, F3 = 50 nm의 G1 = 100 nm의, G2 = 1mm, H1-H2 = 100 nm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. PX "/> 그림 5의 비교 데이터 특성 테이블과 주관적 다른 분할 방법에 적합한 목표.이 표는 각 분할 방법의 장점과 한계를 요약 한 것입니다. 그림 4에서 기준은 분할 방법에 적합한하는 데이터 세트 식별 할 수 있습니다. 이러한 목적 화상의 특성 및 주관적인 개인의 목적은 각 방법의 최적의 사용을 위해 선택하지만, 방해 또는 분할의 효율성을 도움이 될 수 다른 조합. 된 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 효율적인 t 그림 6 의사 결정 흐름도세분화 riage은 다양한 특성을 갖는 데이터 세트를 위해 접근한다. 특성은도 4에서 강조에 기초하여,이 도면은 네 개의 기준이 가장도 3에서 설정된 각 데이터에 대한 최적의 분할 방법에 관한 최종 결정에 기여하는 도면. 각 데이터 세트 인 컬러 빨리 또는 동일한 방식으로 이어지지 않을 수있다 대체 경로를 반영하는 기본 의사 결정 과정을 나타내는 굵은 선뿐만 아니라, 점선을 따라 부호화. kinocilium, 박테리아 및 식물 세포벽 데이터 세트는 최상의 접근법이 자동으로 분할 하였다. 대조적으로, 세포막 및 미토콘드리아 경로는 항상 그들의 어려운 특성 수동 추적로 이어집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.