ボクセルからの知識へ：複雑な電子顕微鏡3D-データのセグメンテーションの実用ガイド

図1は、電子線トモグラフィー、FIB-SEM、及びSBF-SEMを含む3次元電子顕微鏡細胞イメージングのための一般的なワークフローを示しています。ワークフローが選択されたセグメンテーション·ソフトウェアの有効性を最大にするために関心領域をクロッピング、生データの収集、3Dボリュームへのデータのアライメントおよび再建、フィルタリングを通じてノイズリダクション、及び必要な場合が含まれる。このような前処理されたデータは、次に、特徴抽出/セグメント化の準備ができています。 図2は、FIBから生じる他の二つと、電子線トモグラフィー（ 図2A、2B）により記録された樹脂包埋サンプルであるそのうちの2つ（以下にさらに導入される）は、4つの異なるデータセットを図1にレイアウトされたワークフローを示すそれぞれ-semとSBF-SEM（ 図2C、2D）。図2の列1の画像が投影されアライメント·復興の際に3Dボリュームに組み立てられる景色であった（ 図2A1、2B1）とブロックの表面画像（ 図2C1、2D1）、、。列2は、フィルタリング（列3）に基づいノイズの大幅な低減を示し、したがって、多くの場合、より鮮明な表示さなどの3Dボリュームを通してスライスを示しています。 （カラム4）を選択し、関心領域に大きな3Dボリュームをトリミングした後、関心（列5）のセグメント化された特徴の3Dレンダリングを分析定量的に得られ、さらなる検査、色分けすることができる。 6 3Dデータセットの合計は、いずれかの電子線トモグラフィー（3データセット）を介して得られた画像のスタックを含むそれぞれは、FIB-SEM（2データセット）、またはSBF-SEM（1データセット）を、どのようにそれぞれを比較するために使用される4分割方法（ 図3）を行う。データセットは、実験室での異なる研究プロジェクトのさまざまな由来ため、ARを提供典型的な実験データセットのeasonably多様なセット。全てのデータセットは、1つの特定のアプローチに最も精通しているそれぞれの人の4つの独立した研究者によって調べ、それらは6つのデータセットのそれぞれに最適な結果を提供することに仕込んだ。 以下のようなデータセットは、サンプルからである：1。図3A1-3A5：高圧凍結、凍結置換し、樹脂包埋ひよこ内耳有毛細胞不動毛31、2。 図3B1-3B5：高圧凍結、凍結置換し、樹脂包埋植物細胞壁（未発表）、3。 フィギュア3C1-3C5：高圧凍結、凍結置換し、樹脂包埋内耳有毛細胞運動毛（未発表）、4。 フィギュア3D1-3D5：高耐圧人間の乳腺上皮細胞のラミニン豊かextracell中で培養されたHMT-3522 S1腺房に位置ミトコンドリアの凍結し、凍結置換および樹脂包埋ブロックウラルマトリックス32,33、5。 図3E1-3E5：無染色卓上型処理され、硫酸減速細菌バイオフィルムの樹脂包埋ブロック（投稿準備中）、および6 図3F1-3F5：HMTの隣接細胞の膜の境界-3522 S1腺房。 図3から分かるように、異なるセグメント化アプローチは、他のデータ·タイプの一部のデータセットのタイプの大部分は同様の結果が、完全に異なる結果をもたらすことができる。例えば、有毛細胞不動データセット（ 図3A）が解釈し、測定するために最も明確であること、専門家のユーザによって生成されたマニュアル抽象化モデルを持つすべての4つのアプローチで、合理的なセグメンテーションボリュームをもたらす。この場合、そのようなモデルは、フィラメント、フィラメントの距離の迅速な測定を可能にする細長いフィラメント間に見られるリンクの数のカウント、ならびに対応する密度マップの欠落部分の決定試料が試料調製34中に破損した場所へ。このような情報は、特注の自動抽出は、純粋密度ベースのしきい​​値よりも良好な結果を提供するが、他の三つのセグメンテーション手法を用いて取得することがはるかに困難である。 植物細胞壁（ 図3B）は、マニュアルモデル生成は、他のアプローチのいずれも達成していない細胞壁、中程度の感覚を伝える最も効率的であるように見えた。しかし、抽象化されたモデルは、データセット内のオブジェクトの混雑をキャプチャしません。手動で関心のある特徴をトレースすると、密度ベースまたは形状監督の手法よりも良い結果が得られているようだ。一方、マニュアルトレースは非常に労働集約的であり、特徴の識別境界はやや主観的である。したがって、自動化されたアプローチは、精度との間の潜在的なトレードオフで大量のセグメント化することが好ましい場合があるマニュアルセグメンテーションに費やさ資源。 運動毛データセット（ 図3C）は、マニュアル抽象化モデル生成は、最もクリーンな結果が得られ、運動毛の中心に3微小管の予想外のアーキテクチャを明らかにし、トリミングされたデータに容易に見えるディテールが、すべての他のアプローチで失わおそらく染色の不均一に起因する。しかし、密度マップの他の潜在的に重要な機能には、抽象モデルの手動生成に失敗している。これは手動モデル形成の主観的な性質は、モデル形成の間に主観的解釈に従って、観察される実際の密度の理想化と抽象化につながり、という事実に起因する。したがって、この例では、うまく抽象化されたモデル生成は1が3Dボリュームの特定の側面に集中することができますどのようにマニュアルを示しています。しかし、選択的知覚と単純化は、すべてのタンパク質の共同の完全なアカウントを与えることができないデータセット内に存在mplexes。目的は、データの複雑さを示すことであるしたがって、1つが他の三つのアプローチのいずれかを添えて優れています。 3Dマトリックス培養乳腺腺房（ 図3D）の場合には、コントラストの高いミトコンドリアの機能を手動でトレースがあまりにも意外に汚染の最低量（最良の結果が得られていないと、簡単にすべての4つのアプローチによってセグメント化されている図3D3）。ただし、手動トレースは非常に労働集約的であり、従って、大量のための限定的な使用のです。クリーンアップのための更なるトリックが使用される場合には、濃度しきい値ベースと形状監修自動化されたセグメント化の両方が、非常によくミトコンドリアを抽出し、ほぼ完全なセグメンテーションをもたらすであろう（ 例えば 、ボクセル密度の特定のしきい値以下にあるすべてのオブジェクト排除）利用できるようにする異なるパッケージ。この場合は、手動の抽象化モデル構築は得られなかった有望な結果、部分的にはミトコンドリアが簡単にボールとスティックモデルで近似することができないため。 細菌の土壌コミュニティ/バイオフィルム（ 図3E）に関しては、4つのアプローチの3つが手動モデル生成は、幾何学的形状により、原因細菌のような生物学的対象を表すの挑戦にうまく行っていないと、妥当な結果が得られます。細菌から生じる細胞外の付属マニュアル機能トレースにおいても自動化されたセグメント化の手法で検出されませんすることができます。シェイプ監督特注の自動化されたセグメント化はさらにさえ、非常に大規模なデータセットを簡単に定量化を可能にした（データは示していない）が、同様の密度にもかかわらず、細菌から細胞外の機能を分離することができます。これは、もともと非常に大規模なデータセットであるため、カスタマイズされた自動化されたセグメント化は、明らかに、他のすべてのアプローチをoutcompetedが、低複雑性の恩恵を受けている可能性があります関心のある対象物の比較的まばらな分布（低い混雑）。 組織様文脈における2つの真核生物細胞（ 図3F）との間のインタフェースを検査するとき、関心のある特徴の唯一のマニュアルトレースは良好な結果が得られた。自動化された密度ベースのセグメンテーション手法は、完全に、隣接するセル間の膜境界を検出できず、セルの形状が容易に近似さや形状と同一視されていないためであっても特注のアプローチ細菌のために明確な成功にもかかわらず、部分的に失敗したバイオフィルム内（ 図3E5）。 セグメンテーションアプローチはいくつかのデータセットではなく、他でよく行うことが図3から観察は、これらのデータセットのそれぞれを特徴付けるかという問題につながっており、データ特性またはに現れ個人の目的の種類を分類することができたかどうか彼らのrespectivとよく一致して電子アプローチ。このトピックの系統的な研究は、以前に行われていないので、最初のステップとして、画像特性と個人的な目的の実証リストの確立は、それぞれのデータセットの特徴抽出のための最適なアプローチを見つけるために彼らの試みで、初心者を導くことがあります。 8項目は、有意は、 図4に示すように同定され、それらは2つの主要なカテゴリーに分けることができる：ややれたデータセットに固有の（1）特徴、および（2）研究者の個人的な目的および他の考慮事項同様に重要ではあるが、主観的。主に3つの追加データセットが導入されると、 図3の 6つのデータセットから引き出される示す例：一方（ 図4A1）は、 シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）植物細胞壁の凍結切片の凍結断層像であり、第二（ 図4A2 、4B1、4D1 </stroNG>） フィギュア3F1-3F5に描かカテゴリーに収まらなくても、以上の実質的に複雑である可能性が非常に複雑で入り組んだ組織をある内耳血管条のFIB / SEMデータセット、第三は（ 図4B2 、4D2）はFiguress 2A1-2A5と3A1-3A5における縦断面図に示されているサンプルコンテンツと同様の断面図での内耳有毛細胞不動の樹脂部分の断層像、である。 画像特性のような客観的基準の分類については、データセットに固有の4特性が重要であることが提案されている。 データのコントラストは、このような明確な細胞小器官、または他の顕著な特徴に立った携帯風景のように低温電子顕微鏡断層像、（2）中間体（ 図4A2）に典型的な、または（3）ハイ（1）低い（ 図4A1）とすることができる（ 図4A3）、kinociの場合のようにz方向内の明確に分離糸状要素のアライメントに起因liary断層像や断面で不動、。 データが急激に定義された境界を持つような組織中の細胞のような2つの近接して配置するオブジェクト、または鮮明な（ 図4B2）、との間には目に見えて明確な境界と、（ 図4B1）ファジーすることができます。これは、部分的にFIB-SEMに比べて、電子断層約2-4倍に本質的に高いデータ·セットの解像度の関数である。当然のことながら、シャープな境界は、マニュアルだけでなく、自動化されたセグメント化のアプローチの両方にとって望ましいが、後者のアプローチのために必須である。 細菌が実質的に容易に自動化された画像セグメンテーションをレンダリング分離を例示コロニー内にあるように、緊密に間隔を置いた植物細胞壁成分、またはまばら（ 図4C2）によって反映されるように、密度マップは、いずれかの混雑した（ 図4C1）であってもよい。 密度マップは、多くの場合、血管（ 図4D1）またはそのような断面において不動と同様の組織と明確に定義された細胞小器官のようなオブジェクト、（周りの線条vascularis組織のような不規則な形状で非常に異なる機能を備えた非常に複雑になる可能性があります図4D2）。 また、比較はやや困難にすべての異なる例において非常に異なるスケールの点に注意してください。 別にそのような画像特性など、より客観的な基準から、適切なパスの選択をガイドします4非常に主観的な基準も提案されています。 所望の目的：目的は、その複雑さの毛束不動毛を可視化するために、物体（ 図4E1）の形状を決定および確認する、または密度マップに組み込まれている単純化され抽象化されたボールとスティックモデルを作成することであるとことができ、高速カウントndは幾何学的なオブジェクト（フィラメントの長さ、距離、接続数）の測定（ 図4E2）。 機能形態は非常に不規則など、アクチンフィラメント、クロスなどの大部分は細胞間相互作用のようなミトコンドリア（ 図4F2）とやや同様にいくつかのバリエーションで輪帯（ 図4F1）、、、または同一形状、などの細胞のように複雑になることがあります縦向き（ 図4F3）での毛束内のリンク。 一セグメントに3Dデータセット内のすべての機能を望む可能性がある植物細胞壁（ 図4G1）、または細胞容積の小さな部分だけの場合のように関心（人口密度）の機能の割合は、重要であるとしては、異種の細胞のシーン（ 図4G2）におけるミトコンドリアの場合である。データセットのサイズとセグメント化を必要とする体積の割合に応じて、使用するのが最も効率的である手動のアプローチ。そのような一つのさまざまな機能に関心がある場合など、他の場合では、単に半自動セグメンテーションアプローチを使用する代替はありません。 もう一つの重要な主観的な基準は1つがセグメント化プロセスに投資する用意があるリソースの量で、忠実度のレベルは、生物学的な質問に答えるために必要とされている。一つは、必要と多くの注意が、正確な定量的情報（ 図4H1）を得るために必要とされ得る場合には（例えば、サイズ、体積、表面積、長さ、他の機能からの距離、のような）機能の体積パラメータを定量化する必要があるかもしれないまたは目的は、単に、その3次元形状（ 図4H2）の写真をスナップする場合があります。リソースが無制限である理想的な世界で、人は明らかに妥協をするのではなく、ユーザー支援マニュアルの特徴抽出の最も正確なパスを選ぶのは嫌だ。これは多くのデータセットのために働くことができますが、近い将来に3Dボリュームは、WIL lは10K以上により10Kによって10K程度であり、マニュアルセグメンテーションは、もはやそのような巨大な空間を分割するに重要な役割を果たしていることができないでしょう。データ及び他のデータ特性の複雑さに応じて、半自動セグメント化が必要になることがある。 図5では、長所と短所を簡単に4セグメンテーションアプローチを記載されています。各アプローチとペアリングすることができます。図4で特定の個人の目的と画像特性も同様に概説されている。 図6は、6つのデータセットの個人的な目標および画像特性データをトリアージし、最善のアプローチを決定する方法を例示する。どちらも、5と6は議論で合意展開されるフィギュア 。 ロード/ 51673 / 51673fig1highres.jpg "幅=" 500px "/> 生物学的なイメージング·復興および分析のための図1のワークフロー。このチャートは、さまざまな収集するためにとった措置及び断層撮影によって収集されたプロセス画像の概要を示し、イオンビームSEMを集中し、シリアルブロック面のSEM。 2Dチルトシリーズまたは連続切片における生データの収集結果。これらの2D画像セットは、ノイズを低減し、関心のある特徴のコントラストを高めるために、ろ過、3次元に配列し、再構成されなければならない。最後に、データをセグメント化することができ、最終的には、3Dモデルで、その結果、分析した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 図2。断層撮影法及びFIB-SEMとは異なるデータ·タイプのワークフローの例として、ワークフローの各ステップは、データ収集は、4つのデータセット（行AD）を介して示された後：。縦断不動の樹脂埋め込 ​​み染色された断層撮影、植物細胞壁の樹脂埋め込 ​​み染色された断層撮影法セルロース、乳房上皮細胞のミトコンドリアのFIB-SEM、及びE.のSBF-SEM 大腸菌 。生データを介して2Dスライスがカラム1に示され、そしてアラインメントおよび三次元再構成後のデータからの画像は以下の通りで列2、列3に適用されるフ​​ィルタリング技術を含む：メディアンフィルタ（A3）を、非異方性拡散フィルタ（B3）、ガウスぼかし（C3）、およびMATLABの関数imadjustフィルタ（D3）。 3Dは、列5にスケールバーのレンダリングなどの関心のトリミングされたエリア（列4）から各データ·セットのための最良のセグメンテーションの例が表示されます。A1〜A3 = 200nmで、A4 = 150nmで、A5 = 50nmとし、 B1-B3 = 200nmで、B4-B5 = 100nmで、C1-C3 = 1mmのC4-C5 = 500nmで、D1〜D3 = 2ミリメートル、D4-D5 = 200nmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 4分割の図3。応用例のデータセットへのアプローチシックスのデータセットの例は、すべての4つのアプローチによってセグメント化された：。マニュアル抽象化モデル生成、マニュアルトレース、自動化された密度ベースのセグメント、およびカスタマイズされた自動化されたセグメント化。目的は、定量的な目的のためのモデルを作成するのではなく、密度を抽出することであったように手動抽象化モデル生成は、不動毛（A）の染色された断層撮影埋め込み樹脂に有効であった。樹脂としては、植物細胞壁（B）の染色された断層撮影、自動化された密度に基づくsegmenta組み込みションはすぐに手動の方法は、データの唯一のいくつかのスライスに多くの手間がかかったように、多くのスライスを、通ってセルロースを抽出するための最も効果的な方法であった。他の分割方法はしなかったしながら、マニュアル抽象化モデル生成は、運動毛（C）の染色断層撮影における微小管トリプレットを生成し、まだ2自動化されたアプローチは、より迅速に密度を抽出し、そのため好ましかった。による乳房上皮細胞（D）のFIB-SEMからのミトコンドリアの形状に、マニュアルトレースはきれいな結果を提供し、低人口密度が迅速なセグメンテーションに許容される補間方法の使用と組み合わせる。セグメント化するために必要な大量の与えられた、カスタマイズされた自動化されたセグメンテーションは、SBF-SEM細菌データ（E）セグメントに最も効率的であることが判明したが、両方の自動アプローチは同等であった。時間がかかるが、乳房上皮細胞膜のFIB-SEM（F）を抽出するための唯一の方法はマニュアルトレースあっスケールバー：A1〜A5 = 100nmで、B1〜B5 = 100nmで、C1-C5 = 50nmで、D1〜D5 = 500nmであり、E1〜E5 = 200nmで、F1〜F5、バー= 500nmで。 見るにはこちらをクリックしてください。この図の拡大版。 データセットを切り分けるために、図4客観的画像特性と主観的個人的な目的を、データセットの特性の例を使用しては、基準を使用するセグメンテーションアプローチするかの判定を通知するために提案されている。客観的な特性に関しては、データは本質的にファジーまたはクリスプ（B1-B2）であっても、低いコントラスト、中、高（A1-A3）を有することができる、（C1-C2）間隔をあけ、または混雑し、持つ複雑なまたは単純組織化された特徴（D1-D2）。主観の個人的な目的は、目的のOが含まれ bjective単純化したモデルを対象に、または正確な濃度（E1-E2）を抽出、関心（F1〜F3）の特徴である複雑なシート、複雑なボリューム、または線形の形態を特定する、関心のある特徴の高いまたは低い人口密度を選択する（G1-G2）、およびそのような時間（H1-H2） スケールバーとして投資の収穫逓減のための高忠実度と高リソース割り当ての間にはトレードオフの際に決定する：A1 = 50nmで、A2 = 1500nmで、A3 = 100nmで、B1 = 1500nmで、B2 = 200nmで、C1 = 100nmで、C2 = 200nmで、D1 = 10mmのD2 = 200nmで、E1 = 100nmで、E2 = 50nmで、F1-F2 = 500nmであり、F3 = 50nmで、G1 = 100nmで、G2 = 1ミリメートル、H1-H2 = 100nmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 ピクセル "/> 図5の比較データ特性のテーブルと主観的には、異なるセグメント化アプローチのための適切な目的としています。このテーブルには、各セグメント化アプローチの長所と短所をまとめたものです。 図4からの基準は、分割方法に適したデータセットを特定するのに役立ちます。これらの客観的な画像特性と主観の個人の目標は、それぞれのアプローチの最適な使用のために選択したが、別の組み合わせは、セグメント化の効率を妨げるか、助けることができる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 効率的なtについて図6意思決定フローチャートセグメンテーションのキャリッジは、さまざまな特性を持つデータ·セットに近づく。特性に基づいて、図4で強調表示、この図は、4つの基準は、 図3から、各データセットのための最良のセグメンテーション·アプローチに関する最終決定に最も寄与した。各データセットである示して色はすぐに、または同じアプローチにつながらない可能性があり、代替パスを反映原発意思決定プロセスを表す太い線と同様に、点線に従うようにコード化された。運動毛、細菌、および植物細胞壁のデータセットは、最高の2自動化アプローチとセグメント化された。これとは対照的に、細胞膜やミトコンドリアのパスは常に、それらの困難な特性にマニュアルトレースにつながる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。