Static Adesione saggio per lo Studio della integrina attivazione nei linfociti T

T linfociti adesione è un processo fondamentale nella risposta immunitaria ^1. E 'richiesto per l'interazione delle cellule T con le cellule endoteliali decorare le pareti dei capillari, per antigene scansione cellule presentanti (APC) entro linfonodi, e per la formazione di sinapsi immunologiche (IS) con cellule bersaglio ^2. Questi requisiti sono funzionalmente e cineticamente distinti. Il processo di linfociti stravaso si compone di chemiotassi, laminazione, ferma adesione e la trasmigrazione. La transizione dalla laminazione a rassodare adesione richiede cellule T per rispondere a un segnale recettore accoppiato a proteina G rapidamente. Questa risposta produce un'interazione ligando integrina che rallenta e arresti la cella di rotolamento ^3. Un cambiamento immediato nel avidità delle integrine media questo processo. La migrazione richiede interazioni betweenTcells dinamici e cellule endoteliali, con la formazione di aderenze al 'front end' e la rottura delle aderenze alla 'coda'con un intervallo di circa un minuto tra formazione e la rottura ^4. La IS forma inminutes, ma deve rimanere intatta per ore ^6.

È interessante notare che, una molecola di adesione, la funzione dei linfociti membro della famiglia delle integrine antigene associato (LFA) – 1, è essenziale per tutti questi processi ^5. LFA-1 media l'adesione attraverso interazioni con diversi membri della superfamiglia delle immunoglobuline. Il ligando più studiato con la più alta affinità di LFA-1 è la molecola di adesione intercellulare (ICAM) -1. Linfociti circolanti non attivati ​​esprimono bassa affinità LFA-1 sulla superficie cellulare, e quindi sono in grado di aderire alle superfici ICAM-1-rivestita. LFA-1 affinità è variabile e regolata da diversi eventi di segnalazione come la proteina recettore accoppiato attivazione G, stimolazione di citochine, e segnali mediati da recettori delle cellule T (TCR). La risultante forma alta affinità di LFA-1 trasmette l'attivazione intracellulare allo spazio extracellulare tttraverso interazioni con ICAM-1. Questo percorso è definito dentro-fuori di segnalazione ^7. Analogamente, la segnalazione attraverso LFA-1 dallo spazio extracellulare è chiamato dall'esterno all'interno segnalazione.

Il intracellulare cascate di segnalazione coinvolte nel inside-out e outside-in di segnalazione sono un obiettivo importante della ricerca attuale. La piccola GTPasi Rap1 è recentemente emerso come il componente chiave di inside-out di segnalazione che è comune ad entrambi legatura TCR e citochine segnalazione ^8. Il ruolo critico di Rap1 in attivazione integrina è evidenziata dalla scoperta che la sovraespressione di Rap1 stimola integrina-dipendente adesione delle cellule T, mentre l'adesione delle cellule T è bloccato da espressione di dominante Rap1 negative ^9. Questi progressi nella nostra comprensione della regolazione integrina da Rap1 sono state compiute utilizzando strumenti in vitro. Tra questi è il saggio adesione statica qui descritto.

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di studiare Tadesività e ICAM-1 superfici rivestite. Più specificamente, viene utilizzato per misurare obiettivamente e quantificare LFA-1 affinità verso i suoi contatore ligandi in cellule vive in tempo reale, in condizioni diverse. Questa tecnica utilizza pozzetti di polistirene rivestite con ICAM-1 per imitare le superfici cellulari che le cellule T interagiscono. Molti saggi di adesione delle cellule T statico precedentemente descritti potessero sperimentalmente complesso. Questi saggi spesso richiesti per le cellule T siano marcati radioattivamente, utilizzate cellule corneali bovina coltivate per creare una matrice extracellulare come substrato per l'adesione delle cellule T, o chiamati per non fisiologica stimolazione delle cellule T durante un periodo prolungato di promuovere l'adesione delle cellule T ^10. L'uso di misurazione fluorimetrica quantificare cellule T a seguito dell'incubazione adesione è un metodo più sensibile e preciso di quantificazione rispetto alla citometria a flusso e microscopia, come sono utilizzati in molti altri sistemi di dosaggio ^11. Inoltre, microscop singola cellaanalisi ic Geografica integrina non consente l'ampio, popolazione sulla base dell'analisi nello stesso modo come la misurazione fluorimetrica. Mentre LFA-1 anticorpi specifici dello stato di attivazione sono disponibili in commercio, questi anticorpi offrono una bassa sensibilità rispetto al metodo descritto qui. Il principale vantaggio rispetto alle tecniche alternative è la sua semplicità e la capacità di esaminare più condizioni sperimentali contemporaneamente. Quando si considera questo metodo per una specifica applicazione, si dovrà tener conto che le cellule T devono essere selezionati negativamente, appena isolate, e marcate con un marcatore fluorescente.