ثابت التصاق الفحص لدراسة إنتغرين تنشيط الخلايا اللمفية تي في
Summary
ثابت التصاق الاختبار هو أداة قوية التي يمكن استخدامها لنموذج التفاعلات بين الخلايا الليمفاوية T وأنواع الخلايا الأخرى. يتم إنشاؤها التفاعلات عن طريق حقن خلايا T وصفت في الآبار المغلفة مع جزيئات الالتصاق، في حين يتم استخدام قارئ لوحة لتحديد عدد الخلايا الملتصقة التالية يغسل المسلسل.
Abstract
مطلوب تي اللمفاويات التصاق لعدة وظائف الخلايا التائية، بما في ذلك الهجرة إلى مواقع الالتهاب وتشكيل نقاط الاشتباك العصبي مع الخلايا المناعية تقديم المستضد. خلايا T إنجاز التصاق التنظيم من خلال التحكم في خصائص لاصقة من لل integrins، فئة من جزيئات التصاق الخلية تتكون من أزواج من البروتينات عبر الغشاء heterodimeric التي تتفاعل مع الجزيئات المستهدفة على الخلايا شريك أو المصفوفة خارج الخلية. أبرز الخلايا التائية إنتغرين هي وظيفة الخلايا اللمفاوية المرتبطة مستضد (LFA) -1، وتتألف من وحدات فرعية αL وβ2، هدفها هو جزيء التصاق الخلايا (ICAM) -1. قدرة الخلايا التائية للسيطرة على التصاق مستمد من القدرة على تنظيم الدول تقارب لل integrins الفردية. يصف من الداخل إلى الخارج إشارات العملية التي الإشارات داخل الخلية يسبب المجالات الخارجية لل integrins لتولي دولة تفعيلها. ويستند الكثير من معرفتنا لهذه الظواهر المعقدة على الآليةالدراسات التي أجريت في نظم مبسطة في نموذج المختبر. تي اللمفاويات التصاق مقايسة الموصوفة هنا هو أداة ممتازة تسمح خلايا T التمسك استهداف جزيئات، في ظل ظروف ثابتة، ومن ثم يستخدم قارئ لوحة الفلورسنت لتحديد الإلتصاق. وكان هذا الاختبار مفيدا في تحديد المواد المحفزة أو المثبطة التصاق التي تعمل على الخلايا الليمفاوية، فضلا عن تميز الأحداث يشير المعنية. على الرغم من وصفها هنا لLFA-1 – ICAM-1 التصاق بوساطة؛ هذا الاختبار يمكن تكييفها بسهولة للسماح لدراسة التفاعلات الأخرى لاصقة (مثل VLA-4 – فبرونيكتين).
Introduction
تي اللمفاويات التصاق هو عملية أساسية في الاستجابة المناعية 1. هو مطلوب منها لT تفاعل الخلايا مع الخلايا البطانية تزيين جدران الشعيرات الدموية، لمسح مستضد تقديم الخلايا (APC) داخل الغدد الليمفاوية، وتشكيل نقاط الاشتباك العصبي المناعية (IS) مع الخلايا المستهدفة 2. هذه المتطلبات وظيفيا ومتميزة kinetically. تتكون عملية التسرب من الخلايا الليمفاوية chemoattraction، المتداول، التصاق شركة، والتهجير. الانتقال من المتداول لشركة التصاق خلايا T يتطلب للرد على بروتين G جانب إشارة مستقبلات بسرعة. هذا الرد ينتج التفاعل يجند إنتغرين التي تبطئ والاعتقالات الخلية المتداول 3. تغيير فوري في الطمع إنتغرين يتوسط هذه العملية. يتطلب الهجرة التفاعلات betweenTcells ديناميكية والخلايا البطانية مع تشكيل الالتصاقات في "الواجهة الأمامية" والكسر من التصاقات في "النهاية الخلفية"مع فاصل من حوالي دقيقة واحدة بين تشكيل وكسر 4. ويشكل IS inminutes، ولكن يجب أن يظل سليما لساعات 6.
ومن المثير للاهتمام، واحدة جزيء التصاق، وظيفة الخلايا اللمفاوية أفراد الأسرة إنتغرين المستضد المرافق (LFA) – 1، أمر ضروري لجميع هذه العمليات 5. LFA-1 تتوسط الالتصاق من خلال التفاعل مع عدد من أعضاء الفصيلة المناعي. يجند معظم درس على نطاق واسع وفقا لأعلى تقارب إلى LFA-1 هو جزيء التصاق بين الخلايا (ICAM) -1. الخلايا الليمفاوية المنتشرة غير تنشيط تعبير عن انخفاض تقارب LFA-1 على سطح الخلية، وبالتالي غير قادر على الانضمام إلى السطوح ICAM-1-المغلفة. LFA-1 تقارب هو متغير وينظم العديد من الأحداث يشير مثل البروتين يقترن G تنشيط مستقبلات، والتحفيز خلوى، والإشارات بوساطة مستقبلات الخلايا التائية (TCR). الناتج شكل تقارب عالية من LFA-1 ينقل تنشيط الخلايا إلى الفضاء خارج الخلية رالتفاعلات hrough مع ICAM-1. ويطلق على هذا المسار من الداخل إلى الخارج مما يشير 7. وبالمثل، من خلال إشارات LFA-1 من الفضاء خارج الخلية يسمى خارج في الإشارة.
في داخل الخلايا مما يشير شلالات تشارك في الداخل إلى الخارج وخارجها في إشارة هي نقطة تركيز رئيسية في الأبحاث الحالية. برزت في الآونة الأخيرة GTPase Rap1 الصغيرة كعنصر رئيسي من الداخل إلى الخارج مما يشير إلى أن من الشائع أن كلا ربط TCR ويشير خلوى 8. وسلط الضوء على الدور الحاسم للRap1 في تفعيل إنتغرين من اكتشاف أن overexpression من Rap1 يحفز تعتمد على إنتغرين التصاق الخلايا T، في حين تم منع التصاق الخلايا التائية عن طريق التعبير عن المهيمنة Rap1 السلبية 9. وقد تم إنجاز هذا التقدم في فهمنا للتنظيم إنتغرين بواسطة Rap1 باستخدام الأدوات في المختبر. من بينها هو مقايسة التصاق ثابت الموصوفة هنا.
الهدف العام من هذا الأسلوب هو دراسة Tالإلتصاق الخلية إلى ICAM-1 الأسطح المطلية. وبشكل أكثر تحديدا، يتم استخدامه لقياس موضوعي وقياس LFA-1 تقارب نحو بروابط مضادة في الخلايا الحية في الوقت الحقيقي، في ظل ظروف مختلفة. يستخدم هذا الأسلوب الآبار البوليسترين المغلفة مع ICAM-1 لتقليد السطوح الخلوية أن الخلايا T التفاعل معه. وكانت العديد من فحوصات التصاق الخلية T ثابت سبق وصفها معقدة تجريبيا. هذه المقايسات اللازمة لفي كثير من الأحيان الخلايا التائية ليكون المسمى بالإشعاع، استخدمت خلايا القرنية البقري مثقف لإنشاء المصفوفة خارج الخلية والركيزة لالتصاق الخلايا التائية، أو دعا لغير الفسيولوجية تحفيز الخلايا التائية على مدى فترة طويلة لتعزيز التصاق الخلية T 10. استخدام القياس فلوروميتريك لتحديد خلايا T بعد الحضانة التصاق هي طريقة أكثر حساسية ودقة من القياس الكمي بالمقارنة مع التدفق الخلوي والفحص المجهري، كما تستخدم في العديد من أنظمة الفحص الأخرى 11. بالإضافة إلى ذلك، microscop خلية واحدةلا يسمح تحليل جيم من إنتغرين توطين ل، تحليل واسع النطاق السكان مقرها في بنفس طريقة قياس فلوروميتريك. في حين أن التنشيط محددة للدولة LFA-1 الأضداد المتاحة تجاريا، هذه الأجسام المضادة توفر حساسية منخفضة نسبة إلى الطريقة الموضحة هنا. والميزة الرئيسية على التقنيات البديلة هو بساطته والقدرة على دراسة ظروف تجريبية متعددة في نفس الوقت. عند النظر في هذا الأسلوب من أجل تطبيق معين، ينبغي للمرء أن يأخذ في الاعتبار أن الخلايا T يجب أن يكون محددا سلبيا، طازجة معزولة، والمسمى مع علامة فلوري.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك عدة فحوصات لدراسة الإشارات إلى LFA-1 وتفعيل الخلايا التائية التصاق 12. التدفق الخلوي يستخدم لقياس LFA-1 على تقارب في الخلايا الحية باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة التي تربط بشكل انتقائي لمحني إما تمديد أو LFA-1. واحدة من القيود المفروضة على هذه الطريقة هو ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hirschil الثقة، مايكل سابرستين الطبية علماء أبحاث صناديق، وزمالة جامعة نيويورك وايتهيد أيد هذا العمل.
Materials
| Plate reader | BioTek | Synergy H1 Hybrid | |
| Multichannel pipette | Fisher | 21-377-829 | |
| 96-well microplate with optical bottom | Corning Costar | 3603 | |
| Recombinant ICAM-1 | R&D Systems | ADP4-050 | |
| Anti-CD3 antibodies | Ancell | 144-020 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| CFSE | Molecular Probes | C1157 | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| DPBS containing calcium and magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Peripheral lymphocytes | e.g. mouse or human | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 499609 | |
| Open Gen 5 software | BioTek | Version 2.01 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| 15 and 50 mL centrifuge tubes | Fisher | 352099, 352070 | |
| Disposable plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| T-75 culture flasks | Fisher | 50-754-1366 | |
| RosetteSep T cell enricment kit | StemCell Technologies | 15061 |
References
- Dustin, M. L., et al. Membranes as messengers in T cell adhesion signaling. Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).
- Mor, A., et al. GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling. Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).
- Rose, D. M., et al. Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration. Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).
- Alon, R., Feigelson, S. W. Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts. Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).
- Griffith, J. W., Luster, A. D. Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies. Eur J Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).
- Dustin, M. L. Cell adhesion molecules and actin cytoskeleton at immune synapses and kinapses. Curr Opin Cell Biol. 19 (5), 529-533 (2007).
- Springer, T. A., Dustin, M. L. Integrin inside-out signaling and the immunological synapse. Curr Opin Cell Biol. 24 (1), 107-115 (2012).
- Mor, A., et al. D1 regulates lymphocyte adhesion via upregulation of Rap1 at the plasma membrane. Mol Cell Biol. 29 (12), 3297-3306 (2009).
- Bivona, T. G., et al. Rap1 up-regulation and activation on plasma membrane regulates T cell adhesion. J Cell Biol. 164 (3), 461-470 (2004).
- Zeltzer, E., et al. Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin. Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).
- Bhattacharyya, S. P., et al. Both adhesion to immobilized vitronectin and Fc epsilon RI cross-linking cause enhanced focal adhesion kinase phosphorylation in murine mast cells. Immunology. 98 (3), 357-362 (1999).
- Dustin, M. L., Groves, J. T. Receptor signaling clusters in the immune synapse. Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).
