JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생물학

הערכת תרומות מינים ספציפיות כדי Craniofacial פיתוח באמצעות מפלצות שליו-ברווז

Published: May 31, 2014
doi:
10.3791/51534
,
1Department of Orthopaedic Surgery,University of California at San Francisco

Summary

מאמר זה מתאר שיטה ליצירת עוברי chimeric שנועדו לבחון את תרומתם מינים ספציפיים של רכס עצבי ו / או רקמות אחרות לפיתוח craniofacial.

Abstract

הדור של עוברי chimeric הוא גישה נפוצה ורבה עוצמה כדי לחקור את הגורל תא, אינטראקציות רקמות, ומינים ספציפי תרומות להיסטולוגית ופיתוח מורפולוגי של עוברי החולייתנים. בפרט, השימוש בעוברי chimeric ביסס את חשיבותו של רכס עצבי בהכוונת מורפולוגיה המינים ספציפיים של מתחם craniofacial. השיטה המתוארת במסמך זה מנצלת שני מיני עופות, ברווז ושליו, עם מורפולוגיה craniofacial שונה להפליא. שיטה זו מאוד מקלה על החקירה של רגולציה מולקולרית ותאית של דפוס מינים ספציפיים במתחם craniofacial. ניסויים בעוברי chimeric שליו וברווז כבר חשפו אינטראקציות עצביות בתיווך פסגת רקמות והתנהגויות תאים אוטונומיים המווסתים את תבנית מינים ספציפיים בשלד craniofacial, השרירים, וintegument. המגוון הגדול של נגזרי רכס עצביים מצביע על פוטנציאל משמעותיעבור יישומים עתידיים של מערכת chimeric שליו-ברווז להבנת התפתחות חוליות, מחלה, והתפתחות.

Introduction

שלד הפנים מתפתח מהצמיחה ושילוב של תהליכי פנים מרובים שמורכבים מרכס העצבי וmesenchyme mesodermal המוקף ectodermal ושכבות אפיתל endodermal 1-11. אירועי morphogenetic בתוך כל תהליך נשלטים על ידי אינטראקציות איתות ברורות בין mesenchyme וepithelia סביב 12-16. שינויים באינטראקציות אלה איתות ו / או effectors במורד הזרם שלהם לתרום לפנוטיפים מחלה ויכולים גם להיות רלוונטי להתפתחות של שלד craniofacial 17, 18. לכן, הבהרת העיתוי ואופי אינטראקציות רקמה יש פוטנציאל גדול להגדיל את ההבנה של הביולוגיה התפתחותית ואבולוציה של שלד הפנים שלנו.

השימוש בעוברי chimeric לחקור אינטראקציות רקמה יש היסטוריה ארוכה בביולוגיה התפתחותית. גישה זו הייתה חלוץ ידי הנס Spemann והמעבדה שלושגילו את "מארגנים" עובריים על ידי השתלת רקמות בין העוברים של מינים דו חיים שונים. Spemann היה אמן של טכניקות מיקרו כירורגים שיד כישוריהם כהשלמה הפיתוח של כלים מיוחדים, בעיקר פיפטה Spemann. ויקטור המבורגר היה סטודנט לתואר שני במעבדה של האנס Spemann בפרייבורג במהלך 1920s, וזה כאשר ניסויי ההשתלה המקוריים שהובילו לפרס נובל של Spemann בוצעו. כאשר המבורגר עבר לאוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס ב1935, הוא פרט את התהליך של קבלת micropipette Spemann בידנית של ניסויי אמבריולוגיה 19. דרו Noden היה סטודנט לתואר שני במעבדתו של המבורגר באוניברסיטת וושינגטון עד 1972. לאחר שעברו לאוניברסיטה של ​​מסצ'וסטס, אמהרסט ולאחר מכן לאוניברסיטת קורנל, Noden המשיך בודה ובאמצעות micropipettes Spemann להשתלות כירורגית מעורבת מפלצות שליו חומוס. &160 #;. בעוד סטודנט לתואר שני, אחד מהמחברים (ריץ' שניידר) התאמנו עם דרו Noden באוניברסיטת קורנל 1995-1998 הפרוטוקול להכנת micropipette Spemann הבא מבוסס על תיאורים שנכתבו על ידי המבורגר וNoden, וכולל שינויים שנערכו נעשו על ידי שניידר.

השימוש במפלצות שליו חומוס ללימוד פיתוח craniofacial ובמיוחד להבנת תרומתם של תאי רכס עצביים היה חלוץ ידי Noden ועל ידי Le Douarin בתחילת 1970s, שנסקרו בLe Douarin אח' 20. גישה זו אומצה באופן נרחב במחקרים רבים ועל ידי חוקרים רבים אחרים 1, 4, 5, 21-38. השיעורים המקבילים של צמיחה ומורפולוגיה של שליו וחומוס עושים השתלות בתוכם אידיאליים לחקר גורל תא ומעקב שושלת. עם זאת, בגלל הדמיון בין השליו וחומוס, שינויים מורפולוגיים induced ידי תאי תורם הוא קשה לפענוח. לעומת זאת, מערכות chimeric עופות אחרות כללו ברווז מקומי כדרך ללמוד מנגנונים ההופכים את העוברים נפרדים 39-50 מבחינה אנטומית. באופן ספציפי יותר, מערכת chimeric שליו-הברווז מציעה יתרונות מרובים להבחנה את השפעותיו של התורם במחשב המארח, ולהיפך. ראשית, עוברי שליו וברווז נבדלים בגודל גוף ובצורה, אשר מספק דרך ישירה כדי לחקור תורם או מנגנוני מארח ספציפי של היווצרות דפוס על ידי assaying לתחומים ההפרש של ביטוי גנים (איורים 1 ו-B). שנית, יש עוברי שליו וברווז שיעורים שונים במידה ניכרת של התבגרות, עם שליו בקיעה ב17 ימים וברווז בקיעה ב28 ימים. רכס עצבי מושתל שומר על קצב ההבשלה הפנימי שלה בתוך סביבת המארחת, ובכך, זיהוי של שינויים זמניים בביטוי גנים, אינטראקציות רקמות, histogenesis, והמורפוגנזה אפשרי51-57. לבסוף, נוגדני גרעין אנטי שליו (ש ¢ PN) מאפשר תרומות סלולריות תורם ולארח להיות באופן קבוע נבדלות זו מזו על ידי הכרת חלבון שבא לידי ביטוי בכל מקום בתאי שליו, אבל נעדר מתאי ברווז.

Protocol

1. הכן את מחטי טונגסטן לחתוך מוט טונגסטן במחצית באמצעות מספרי תיל כדי שהמוט לא מתכופף. השחל את המוט עד הסוף מחודד של 5 3/4 כוס בורוסיליקט פיפטה פסטר. השארת כ 3/4 בשל דבק המוט מהזכוכית, לדבוק המוט לקצה פיפטה עם חרוז קטן של "דבק חם להמיס" (מוזיאון), המהווה את מקל הדבק המשמש לאקדח דבק. HMA צריכה להיות נמסה במהירות בלהבת אלכוהול, נזהר שלא לשרוף את הדבק וליצור עשן שחור. בעזרת זוג המלקחיים, לכופף את קצה מוט טונגסטן (כ 1/4 מהקצה העליון) עד לזווית של ° 45. מחזיק את פיפטה פסטר, הנח על 1/8 מקצה מוט טונגסטן ללהבת לפיד פרופאן. החזק את הקצה יציב ובדיוק בניצב ללהבה. משוך את המחט מתוך להבת רגע גרגר כתום זעיר של טונג נאעשרה זבובי הנחה של המחט. 2. הכן פיפטות Spemann שימוש במבער בונזן, מחמם את הקצה הצר של פיפטה פסטר עד הזכוכית זמן קצר מעבר ללהתחדד מתחילה להתמוסס. להסיר מלהבה ולמשוך את הקצה עד פיפטה הופכת אטומה. להיות בטוח שיש עדיין חלק של החלק מחודד שיש OD של כ 0.7-1.0 מ"מ. לשבור את הסוף סגר על 4 סנטימטר מלהתחדד. צרף סביב 2 רגל (60 סנטימטר) של צינור גומי לקצה הרחב (הפתוח) של פיפטה. מכה בקצה השני של צינור הגומי כדי לוודא ששום אוויר יכול לעבור את החלק מחודד של פיפטה פסטר. שימוש במכל דלק פרופן עם לפיד להבת עיפרון מצורף, לחמם אזור סגלגל בצד אחד של פיפטה בדיוק מתחת לתחילה להתחדד. לפוצץ באוויר בעדינות רבה וכל הזמן דרך צינורות גומי עם כמות קטנה של לחץ (כ כמות הלחץ הדרושה כדי לומר תחילת letter "P" ברמת שיחה). כאשר הזכוכית הופכת רכה בצד אחד ומתחילה לקרוס כלפי חוץ, להסיר במהירות את פיפטה מהאש ולפוצץ קשה ויציב דרך צינורות הגומי. זה יגרום לחלק המחומם של הזכוכית כדי ליצור בועה בצורת נקניק שעלולה לצוץ, וזה בסדר. אם הבועה קטנה מדי, נסה נמס ונושב הזכוכית שוב. החלון הפתוח הסופי בכוס צריך להיות סביב 0.25 ב( 6.35 מ"מ) רחב על ידי ארוך 0.5 ב( 12.7 מ"מ). הצבעה לקצה חד כלפי מעלה, לגרד את הבועה לתוך מיכל פסולת זכוכית בעת נושבת בעדינות דרך צינורות כדי למנוע שברי זכוכית מלהיכנס לפיפטה. שימוש בלהבת הגז, לשרוף את הקצוות הנותרים של הבועה ואש פולנית צידי החלון הפתוח. יש להיזהר שלא להמס את הפיר של פיפטה. שימוש בעיפרון נקודת יהלום, ציון הסוף מחודד של פיפטה כ 1.25 ב( 30 מ"מ) מהחלון ולשבור את הקצהעם מלקחיים כדי שפתיחת פיפטה נחתך בצורה נקיה (טפטפות נזרק עם טיפים שבורים או לא אחידים). בעזרת מלקחיים והקצה של להבה ממבער אלכוהול, לכופף את החלק הצר של פיפטה 0.375 ב( 9.5 מ"מ) מהקצה לזווית של כ 60 מעלות כך שהחלק הכפוף הוא במישור אנכי בעת פתיחת החלון הוא בעמדת 1:00 לשימוש ביד ימין ו -11:00 לשימוש ביד שמאל. צעד זה מתבצע הטוב ביותר במתחם ללא טיוטה. אש פולנית הקצה באמצעות להבת האלכוהול תחת מיקרוסקופ לנתח. הקפד שלא לסגור את הקצה אלא להשאיר את הפתח עגול וחלקה ללא כל התכווצות. חותכי חתיכה של צינור גומי 1 ב( 25 מ"מ), לרסס את חתיכת הצינור עם 70% אתנול, והחלק את צינורות מעל הפיר של פיפטה עד פתיחת החלון מכוסה לחלוטין. זה מתפקד כמו "הסרעפת" של פיפטה Spemann. הנח הנורה מיליליטר לטקס גומי 2מעל התחתית הפתוחה של פיפטה. הנורה שומרת על לחץ שלילי בפיפטה Spemann. לתרגל באמצעות פיפטה Spemann, להעביר חרוזים כרומטוגרפיה של סביב 100-200 מיקרומטר בקוטר ממקום מסומן באחד צלחת פטרי למקום מסומן באחר תחת מיקרוסקופ. כדי לנקות את פיפטה Spemann, הסר את נורת הגומי ופיפטה המקום, להטות כלפי מטה, בכוס גבוהה מרופדת בצמר גפן או גזה בתחתית ומלאה במים מזוקקים וחומר ניקוי זכוכית. 3. לעקר ודגירת ביצים נגב ביצים עם 70% אתנול ומניח את הביצים במגשי ביצי פלסטיק. הגדרת ביצים באינקובטור מחומם ב37.5 ° C ו 85-87%. דגירה ביצים עד שהם מגיעים HH9.5, כ 26 שעה שליו ו48 שעות לברווז. 4. חלון ביצים הסרת חתיכה קטנה של מעטפת חיצונית מהחלק העליון של הביצה עם מלקחיים, נזהרת שלא לנקב מ 'הקליפה הפנימיתembrane. באמצעות מזרק עם 18 G על ידי מחט 1 אינץ, לתקוע חור בקצה הצר של הביצה ולסגת כ 1-2 מיליליטר של חלבון. הנח את סרט הדבקה שקופה מעל החור והסימן לנקב בקליפה. גזור "חלון" על פני השטח העליונים של הביצה (באמצעות סרט ההדבקה השקופה) באמצעות מספריים מעוקלים. 5. דמיינו עוברים ולהתכונן לניתוח באמצעות מוט זכוכית, מבריש בעדינות כמות קטנה של אדום ניטרלי (0.02 גר '/ מיליליטר בBSS של האנק) על העובר. חותכים את קרום vitelline ולמשוך אותו על פני העובר באמצעות מחט טונגסטן חדד להבה. Re-לאטום את הביצה על ידי הצבת קלטת שקופה מעל החלון. 6. הפרד את רקמות התורמות מהעובר התורם הסר את הסרט מהחלון על הביצה של עובר התורם. לחתוך את הקיפול העצבי מהאאקטודרם הצמוד של עובר התורם, להפוך את החריצים בשני sides של הצינור העצבי, באמצעות מחט חדדה להבה טונגסטן (מיוצרת כמתואר לעיל). ואז, חצה את הצינור העצבי ברמות הקדמית וגם האחוריים הרצויות של השתל ולהפריד את השתל משאר הצינור העצבי. הסר את הקיפול העצבי מן עובר התורם או באמצעות פיפטה Spemann או סוג אחר של micropipette. לאחר מכן, הוצא את הקלטת מהחלון על ביצת המארח ולהשתמש פיפטה Spemann למקום הקיפול העצבי תורם לצד עובר המארח בסמוך לאזור של הצינור העצבי שיקבל את ההשתלה. 7. הפרד את רקמות המארח והשתלת רקמות התורמות הפרד את הקיפול העצבי מהצינור העצבי של עובר המארח, כפי שנעשה עם התורם. תשמור על עצמך כדי להסיר את שתל בגודל שווה כמו הרקמות התורמות. דחפו בעדינות רקמות מארח זה רחוק מהעובר. ואז, עם מחט טונגסטן בוטה או הקצה המעוגל של מילcropipette, בעדינות להזיז את עצבי התורם לקפל לתוך הצינור העצבי מארח, שמירה על אוריינטציות Antero, אחורי וdorso-הגחון הראויה. ודא השתל הוא תחוב בלאורך הצדדים, אבל להיות בטוח שלא לתקוע או נזק לרקמות הבסיסיות. כדי לעזור לעקוב אחר פתק הכיוון המקורי סימטריה כלשהו ברקמות התורמות או מכתים ההפרש מהאדום ניטרלי. אנחנו גם צילום מסמך עובר התורם עם הרקמה הנלווית נכרתה, כמו גם את הכימרה מייד לאחר ניתוח. תמיסת מלח סטרילית יש להוסיף לביצה אם עובר המארח מראה סימנים של התייבשות. כעת, בזהירות מחדש חותם ולתייג את הביצה, ובעדינות להחזיר אותו לחממת לחות גבוהה (70-80%) שבו עובר chimeric יכול להתפתח לשלב הרצוי לניתוח. 8. אוסף של מפלצות הקפד לאסוף עובר chimeric במקבע של סרה קרה טרי ומניח אותם באופן מיידי על rocker על 4 מעלות צלזיוס לקיבעון O / N. זה יאפשר זיהוי רגיש יותר של תאי שליו עם הנוגדן אנטי שליו. על ביטוי גני מנתח באמצעות RT-qPCR, להקפיא עובר ישירות בחנקן נוזלי לפני מיצוי RNA.

Representative Results

לפני ניתוח נוסף, את היעילות של ההשתלה צריכה להיות assayed. להיסטולוגית, ביטוי מורפולוגי, או גן מנתח בדגימות רקמה, צריכים להיות מזוהים על ידי אימונוהיסטוכימיה תאי שליו באמצעות נוגדן ש ¢ PN כמתואר 36. עבור RNA ניתוחים, מינים ספציפי תרומות לרקמות של עניין יכולות להיות מחושבים באמצעות אסטרטגיה המבוססת על ה-PCR 58. לאחר היעילות של ההשתלה אומתה, ניתן להעריך מדדי תוצאה מורפולוגיים או מולקולריים נוספים במפלצות. יחסי גומלין בין תאי התורם העצביים פסגה ורקמות הנגזרים מארח סביב העומדות בבסיס histogenesis והמורפוגנזה של מתחם craniofacial הנכונים בעבר נחקרו בהרחבה. בפרט, mesenchyme רכס העצבי מפנה את מורפולוגיה מינים ספציפית של הפנים 7, 13, 51, 59, דפוס נוצה 52, דפוס שרירים 56 </s עד>, וסחוס 53, 57 באמצעות הוויסות של ביטוי גני המארח. לדוגמא, mesenchyme רכס העצבי מכתיב כאשר צורות עצם בלסת התחתונה על ידי temporally ויסות ביטוי Bmp4 55. לאחרונה, החקירות מתמקדות באינטראקציות רקמות המתרחשות בשלב מוקדם מאוד בפיתוח craniofacial. בהקשר זה, ניסויי ניצול מפלצות שליו-ברווז הראו עוברי מארח להשפיע על הגירת רכס עצבית על ידי קביעת גבולות מורפולוגיים. כלומר, בעוברי quck chimeric, תאי רכס עצביים שליו תורם נודדים לתוך קשת הלסת התחתונה, ברווז המארח בדפוס כמו ברווז (1D איור). למרות תרומת מארח זה לגודל אוכלוסיית הרכס העצבית, הרכס העצבי התורם ממשיך לייצר שלד לסת תחתון, שהוא בגודל ובצורה (איור 1E) כמו שליו. דואר 1 "עבור: תוכן width =" 6in "עבור: src =" / files/ftp_upload/51534/51534fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51534/51534fig1.jpg "/> איור 1. מערכת Chimeric שליו-ברווז. (א) שליו ו( ב ') גולגלות ברווז להציג הבדלים ניכרים בגודל ובצורה, ובכך, מתאימות בצורה אידיאלית לשימוש במערכת chimeric ללמוד פיתוח craniofacial (שונה מTokia et al. 56). (C) עיצוב ניסיוני להפקת עוברים חד צדדיים chimeric quck משליו HH9.5 בהתאמה במה ועוברי ברווז. הקיפול העצבי מוסר מצד אחד של עוברים שליו ואחרי חתיכה של הקפל העצבי מקבילה הוסר הושתלו עוברי ברווז. (ד) תאי תורם שליו (ירוק) יכולים להיות מיושמים במפלצות באמצעות נוגדן אנטי שליו (Q ¢ PN) כפי שמוצג בתצוגת הגחון של עובר chimeric HH12. (F) בלסתות quck בHH38, שליו תורם נגזר מקל7; של סחוס הוא קצר יותר וישר יותר מזה שנצפה לסחוס הנגדי הברווז נגזר מארח של מקלה, שהוא גדול יותר ומעוקל. נדפס Tokita et al., Dev. ביו. 306, 377 (2007) באישור Elsevier.

Discussion

הרכס העצבי הוא אוכלוסיית תאים עוברית חולפת שנודדת בהרחבה לאורך כל העובר ומבדיל לסוגים שונים של תאים, כוללים כונדרוציטים וosteoblasts, שתורמים לשלד craniofacial. השתלת רכס עצבי במערכת chimeric שליו-הברווז תרמה רבה להבנה של יחסי גומלין הרקמה ומסלולי איתות המווסתים את התפתחות שלד craniofacial שלנו. עם זאת, בהתחשב בפוטנציאל העצום של רכס עצבי גם לייצר תאי שריר חלק, תאי שומן, מלנוציטים, תאי שוואן, ותאי עצב, מערכת הכימרה שליו-הברווז יש לו פוטנציאל אדיר ליישומים עתידיים, במיוחד בשילוב עם הקידום המהיר של ביולוגיה של תאי גזע ורפואה רגנרטיבית. מאז שליו וברווז הם שני מינים התרבו באופן מסחרי, אספקה ​​מוכנה של ביצים מופרות זולות יחסית היא זמינה ממגוון רחב של משקים. לכן, טכניקה זו צריכה להיות נגישה לresearcשלה הפועל במגוון רחב של תקציבים ושטח מתקן.

למרות שטכניקה זו היא חזקה מאוד, נותרו מספר מגבלות. כמו טכניקות ניתוחיות אחרות, את האיכות ואת הכדאיות של מפלצות שליו-ברווז להסתמך על מיומנויות כירורגיות של החוקר, ולכן, לא תהיה וריאציה יותר הבין ותוך אישי בין ניסויים בהשוואה לדגמים אחרים, כגון עכבר ניצול אלה גנטיקה. יתר על כן, יש גם וריאציה בשיעורי של פיתוח ושלבים של עוברי אדם שתורמים לשחזור ולהצלחה של כל השתלה. עוברי עופות הם גם מאוד רגישים להתייבשות ולכן שלבים קריטיים במהלך הניתוח כוללים שמירה על רמות האור נמוכים, הזמן מתחת למיקרוסקופ עד למינימום, את הביצים חתומות עם קלטת ככל האפשר, ולחות גבוהה בחממה לאחר הניתוח ל להימנע מהתייבשות.

במונחים של כדאיות של מפלצות, usually בין 50-75% לשרוד, למרות שאחוזים אלה יכולים להקטין את מעלה את שלב האיסוף. בפגישת 4-6 שעות טיפוסית של ניתוח, מנתח מנוסה יכול ליצור 10-15 מפלצות. ההצלחה של ההשתלה תלויה גם במידה רבה על איכות הכלים. כלים טובים מובילים לתוצאות עקביות יותר, לשחזור. באמצעות לפיד פרופאן כדי להפוך את מחטי טונגסטן מאפשר מחטים חדות ביותר להתבצע. הסוג של לפיד המשמש עושה הבדל גדול משום שהיא שולטת בגודל של הלהבה. יכול לשמש גם חידוד אלקטרוליטי, אך גישה זו אינה מתקרבת אפילו לייצור מחטים חדות כ. השתמש במוטות טונגסטן במקום חוט נגלל כך שהמחטים יכולות להתבצע ישר.

Micropipette Spemann, בעוד זמן רב וקשה לעשות, הוא כלי אידיאלי להעברת רקמות. פיפטה יכולה להיות מותאמת אישית עם פתחים בגדלים שונים, וניתן להשתמש בם שוב ושוב. גורם קריטי למנצליםmicropipette ga Spemann הוא לקבל קצת נוזל בפיפטה לפני שתיגע בקצה אל פני השטח של העובר. חלק מהנוזל תמיד יזרום החוצה כאשר קשר הוא עשה עם המניסקוס על העובר. לחיצה על הסרעפת מאפשרת רקמת נוזל ושתל להיפלט בדיוק רב, ואילו מעט מרפה על הסרעפת בעדינות מוצצת את רקמת שתל מתורם לתוך פיפטה. שמירה קצת לחץ חיובי על הסרעפת שומרת על רקמת שתל מתורם בקצה פיפטה במהלך העברה, ולחץ נוסף קטן בסרעפת מאפשר את רקמת שתל מתורם כדי להיות ממוקמת במכוון במארח.

להגנה של פיפטה Spemann במהלך אחסון ועיקור, הסר את הנורה מהקצה הרחב ובזהירות הכנס את הקצה מחודד לתוך הנורה. הנח את פיפטה Spemann במבחנה זכוכית, לכסות את החלק העליון בנייר אלומיניום, וחיטוי לפני הניתוח. לאחר טפטפות מרובה הן מחדשעדי לעבור עיקור שוב לניתוח, להפוך את טפטפות, לחמם אותם כמעט לרתיחה באותה התמיסה של מים מזוקקים וחומר ניקוי זכוכית, ולאחר מכן לשטוף שוב ושוב במים מזוקקים. טפטפות החיטוי בצינורות הבודדים שלהם. צינור הגומי שיוצר את הסרעפת ואת הנורה הגומי יש להחליף לאחר מספר עיקורים או כאשר הם הופכים לחשוכים ונוקשים.

רבים מהרכיבים של פרוטוקול זה כרוך בציוד מסוכן. לדוגמא, את ההליך להכנת Micropipette Spemann כולל שלושה סוגים של להבות, כמו גם חימום, מושך, נושבת, כיפוף, חיתוך, ליטוש וזכוכית. לכן, לובש ציוד מתאים מגן אישי (PPE) שמגביר את הבטיחות כגון משקפי מגן וחלוק מעבדה הוא קריטי. בנוסף, משום שאנשים רבים סובלים מ, או שיש לו את הפוטנציאל להתפתח, אלרגיות ביצה, תמיד להשתמש בכפפות בעת הטיפול בביצים. עם אמצעי זהירות אלה בחשבון, מערכת chimeric שליו-ברווז isa שיטה בטוחה, יעילה ונגישה יחסית שיש לו יישומים רבים בעתיד.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה על ידי מכון לאומי למחקר דנטלי Craniofacial מענק F32 (NIDCR) (DE021929) לJLF וDE016402 מענק NIDCR R01 לRAS

Materials

1x PBS TEK TEKZR114
Hank’s BSS w/o Phenol Red Invitrogen 14025-092
Neutral Red Sigma Aldrich N4638-5G .22µm filter-sterilized
18G Needles BD 305195
5 ml syringe BD 309646
No. 5 Dumont forceps Fine Science Tools 11252-20
Straight Scissors Fine Science Tools 14028-10
Curved Scissors Fine Science Tools 14029-10
Spemann Pipet Hand-made in lab
Egg holder Glass ashtray and modeling clay
Alcohol burner Fisher 04-245-1
Transparent tape 3M Scotch 600
Glass Stirring Rod Fisher 11-380C Tip is narrowed and rounded using a flame
Tungston wire (.004 x 3 inches) A-M Systems 7190 Tip is flame-sharpened in a propane torch
Bunsun burner Fisher Scientific  S49117
Pasteur pipette Fisherbrand  22-183-632 9-inch (229 mm) 
rubber tubing Fisher Scientific  14-178C amber, thin wall natural rubber; wall thickness: 0.0625 inches/1.6 mm; O.D.: 0.375 inches/9.5 mm; I.D.: 0.25 inches/6.4mm
 Propane fuel cylinder BernzOmatic UL2317  TX-9 with torch style "A" with a screw-on brass "pencil flame" torch  
Diamond point pencil Fisher Scientific  22-268912
Rubber bulbs Fisherbrand S32325
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Le Lièvre, C. S., Le Douarin, N. M. Mesenchymal derivatives of the neural crest: analysis of chimaeric quail and chick embryos. J Embryol Exp Morphol. 34, 125-154 (1975).
  2. Le Lièvre, C. S. Participation of neural crest-derived cells in the genesis of the skull in birds. J Embryol Exp Morphol. 47, 17-37 (1978).
  3. Noden, D. M. An analysis of the migratory behavior of avian cephalic neural crest cells. Dev Biol. 42, 106-130 (1975).
  4. Noden, D. M. The control of avian cephalic neural crest cytodifferentiation. I. Skeletal and connective tissues. Dev Biol. 67, 296-312 (1978).
  5. Couly, G. F., Coltey, P. M., Le Douarin, N. M. The triple origin of skull in higher vertebrates: a study in quail-chick chimeras. Development. 117, 409-429 (1993).
  6. Noden, D. M., Schneider, R. A. Neural crest cells and the community of plan for craniofacial development: historical debates and current perspectives. Adv Exp Med Biol. 589, 1-23 (2006).
  7. Schneider, R. A. Developmental mechanisms facilitating the evolution of bills and quills. J Anat. 207, 563-573 (2005).
  8. Sperber, G. H. . Craniofacial embryology. , (1989).
  9. Chai, Y., Maxson, R. E. Recent advances in craniofacial morphogenesis. Dev Dyn. 235, 2353-2375 (2006).
  10. Gitton, Y., et al. Evolving maps in craniofacial development. Semin Cell Dev Biol. 21, 301-308 (2010).
  11. Szabo-Rogers, H. L., Smithers, L. E., Yakob, W., Liu, K. J. New directions in craniofacial morphogenesis. Dev Biol. 341, 84-94 (2010).
  12. Francis-West, P. H., Tatla, T., Brickell, P. M. Expression patterns of the bone morphogenetic protein genes Bmp-4 and Bmp-2 in the developing chick face suggest a role in outgrowth of the primordia. Dev Dyn. 201, 168-178 (1994).
  13. Schneider, R. A. How to tweak a beak: molecular techniques for studying the evolution of size and shape in Darwin’s finches and other birds. Bioessays. 29, 1-6 (2007).
  14. Richman, J. M., Lee, S. H. About face: signals and genes controlling jaw patterning and identity in vertebrates. Bioessays. 25, 554-568 (2003).
  15. Graham, A., Okabe, M., Quinlan, R. The role of the endoderm in the development and evolution of the pharyngeal arches. J Anat. 207, 479-487 (2005).
  16. Neubüser, A., Peters, H., Balling, R., Martin, G. R. Antagonistic interactions between FGF and BMP signaling pathways: a mechanism for positioning the sites of tooth formation. Cell. 90, 247-255 (1997).
  17. Wilkie, A. O., Morriss-Kay, G. M. Genetics of craniofacial development and malformation. Nature reviews. Genetics. 2, 458-468 (2001).
  18. Fish, J. L., et al. modularity, and the evolvability of the vertebrate jaw. Evol Dev. 13, 549-564 (2011).
  19. Hamburger, V. . A Manual of Experimental Embryology. , (1942).
  20. Le Douarin, N. M., Creuzet, S., Couly, G., Dupin, E. Neural crest cell plasticity and its limits. Development. 131, 4637-4650 (2004).
  21. Baker, C. V., Bronner-Fraser, M., Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. Early- and late-migrating cranial neural crest cell populations have equivalent developmental potential in vivo. Development. 124, 3077-3087 (1997).
  22. Baker, C. V., Stark, M. R., Marcelle, C., Bronner-Fraser, M. Competence, specification and induction of Pax-3 in the trigeminal placode. Development. 126, 147-156 (1999).
  23. Borue, X., Noden, D. M. Normal and aberrant craniofacial myogenesis by grafted trunk somitic and segmental plate mesoderm. Development. 131, 3967-3980 (2004).
  24. Cobos, I., Shimamura, K., Rubenstein, J. L., Martinez, S., Puelles, L. Fate map of the avian anterior forebrain at the four-somite stage, based on the analysis of quail-chick chimeras. Dev Biol. 239, 46-67 (2001).
  25. Couly, G., Le Douarin, N. M. Head morphogenesis in embryonic avian chimeras: evidence for a segmental pattern in the ectoderm corresponding to the neuromeres. Development. 108, 543-558 (1990).
  26. Couly, G. F., Coltey, P. M., Le Douarin, N. M. The developmental fate of the cephalic mesoderm in quail-chick chimeras. Development. 114, 1-15 (1992).
  27. Köntges, G., Lumsden, A. Rhombencephalic neural crest segmentation is preserved throughout craniofacial ontogeny. Development. 122, 3229-3242 (1996).
  28. Noden, D. M., Francis-West, P. The differentiation and morphogenesis of craniofacial muscles. Dev Dyn. 235, 1194-1218 (2006).
  29. Le Douarin, N. M. A biological cell labelling technique and its use in experimental embryology. Dev Biol. 30, 217-222 (1973).
  30. Lwigale, P. Y. Embryonic origin of avian corneal sensory nerves. Dev Biol. 239, 323-337 (2001).
  31. Marcucio, R. S., Cordero, D. R., Hu, D., Helms, J. A. Molecular interactions coordinating the development of the forebrain and face. , (2005).
  32. Noden, D. M. The Role of the Neural Crest in Patterning of Avian Cranial Skeletal, Connective, and Muscle Tissues. Dev Biol. 96, 144-165 (1983).
  33. Noden, D. M. Patterning of Avian Craniofacial Muscles. Dev Biol. 116, 347-356 (1986).
  34. Olivera-Martinez, I., Coltey, M., Dhouailly, D., Pourquie, O. Mediolateral somitic origin of ribs and dermis determined by quail-chick chimeras. Development. 127, 4611-4617 (2000).
  35. Schienda, J., et al. Somitic origin of limb muscle satellite and side population cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 945-950 (2006).
  36. Schneider, R. A. Neural crest can form cartilages normally derived from mesoderm during development of the avian head skeleton. Dev Biol. 208, 441-455 (1999).
  37. Schneider, R. A., Hu, D., Rubenstein, J. L., Maden, M., Helms, J. A. Local retinoid signaling coordinates forebrain and facial morphogenesis by maintaining FGF8 and SHH. Development. 128, 2755-2767 (2001).
  38. Selleck, M. A. J., Bronner-Fraser, M. Origins of the avian neural crest: The role of neural plate-epidermal interactions. Development. 121, 525-538 (1995).
  39. Waddington, C. H. Developmental mechanics of chick and duck embryos. Nature. 125, 924-925 (1930).
  40. Waddington, C. H. Experiments on the Development of Chick and Duck Embryos, Cultivated in vitro. Philosophical transactions of the Royal Society of London. 221, 179-230 (1932).
  41. Hampe, A. Role of mesoderm and ectoderm of leg bud in exchanges between duck and chicken. C R Hebd Seances Acad Sci. 244, 3179-3181 (1957).
  42. Zwilling, E. Interaction between ectoderm and mesoderm in duck-chicken limb bud chimaeras. J Exp Zool. 142, 521-532 (1959).
  43. Pautou, M. P. Determining role of the mesoderm in the specific differentiation of the leg in birds. Arch Anat Microsc Morphol Exp. 57, 311-328 (1968).
  44. Sohal, G. S., et al. Development of the trochlear nucleus in quail and comparative study of the trochlear nucleus, nerve, and innervation of the superior oblique muscle in quail, chick, and duck. Journal of Comparative Neurology. 239, 227-236 (1985).
  45. Sohal, G. S. Effects of reciprocal forebrain transplantation on motility and hatching in chick and duck embryos. Brain Res. 113, 35-43 (1976).
  46. Sohal, G. S., et al. Synapse formation on quail trochlear neurons transplanted in duck embryos before naturally occurring motor neuron death. International Journal of Developmental Neuroscience. 8, 9-16 (1990).
  47. Yamashita, T., Sohal, G. S. Development of smooth and skeletal muscle cells in the iris of the domestic duck, chick and quail. Cell and Tissue Research. 244, 121-131 (1986).
  48. Yamashita, T., Sohal, G. S. Embryonic origin of skeletal muscle cells in the iris of the duck and quail. Cell and Tissue Research. 249, 31-37 (1987).
  49. Dhouailly, D. Analysis of the factors in the specific differenciation of the neoptile feathers in the duck and chicken. J Embryol Exp Morphol. 18, 389-400 (1967).
  50. Dhouailly, D. The determination of specific differentiation of neoptile and teleoptile feathers in the chick and the duck. J Embryol Exp Morphol. 24, 73-94 (1970).
  51. Schneider, R. A., Helms, J. A. The cellular and molecular origins of beak morphology. Science. 299, 565-568 (2003).
  52. Eames, B. F., Schneider, R. A. Quail-duck chimeras reveal spatiotemporal plasticity in molecular and histogenic programs of cranial feather development. Development. 132, 1499-1509 (2005).
  53. Eames, B. F., Schneider, R. A. The genesis of cartilage size and shape during development and evolution. Development. 135, 3947-3958 (2008).
  54. Lwigale, P. Y., Schneider, R. A. Other chimeras: quail-duck and mouse-chick. Methods Cell Biol. 87, 59-74 (2008).
  55. Merrill, A. E., Eames, B. F., Weston, S. J., Heath, T., Schneider, R. A. Mesenchyme-dependent BMP signaling directs the timing of mandibular osteogenesis. Development. 135, 1223-1234 (2008).
  56. Tokita, M., Schneider, R. A. Developmental origins of species-specific muscle pattern. Dev Biol. 331, 311-325 (2009).
  57. Solem, R. C., Eames, B. F., Tokita, M., Schneider, R. A. Mesenchymal and mechanical mechanisms of secondary cartilage induction. Dev Biol. 356, 28-39 (2011).
  58. Ealba, E. L., Schneider, R. A. A simple PCR-based strategy for estimating species-specific contributions in chimeras and xenografts. Development. 140, 3062-3068 (2013).
  59. Jheon, A. H., Schneider, R. A. The cells that fill the bill: neural crest and the evolution of craniofacial development. J Dent Res. 88, 12-21 (2009).

Tags

Chimeric EmbryosCell FateSpecies-specific ContributionCraniofacial DevelopmentNeural CrestQuailDuckCraniofacial MorphologyMolecular RegulationCellular RegulationSpecies-specific PatternCraniofacial SkeletonCraniofacial MusculatureCraniofacial IntegumentVertebrate DevelopmentDiseaseEvolution

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Fish, J. L., Schneider, R. A. Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras. J. Vis. Exp. (87), e51534, doi:10.3791/51534 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image