ScanLag: High-Throughput-Quantifizierung von Colony Wachstum und Verzögerungszeit

Als ein Beispiel der Verzögerungszeit Verteilungsextraktions, Fig. 5 zeigt die Fähigkeit von ScanLag mit spezifischen Eigenschaften auf eine Platte über die Zeit zu identifizieren und zu verfolgen jede Kolonie, wie sie in einem Screening-Assay durchgeführt werden. Wenn die Kultur des Mikroorganismus ist heterogen, könnten die verschiedenen Subpopulationen sich während des Assays zeigen. Zum Beispiel zeigt Fig. 6 die Darstellung Quantifizierung und somit zeigt bimodale Verzögerungszeitverteilung in einem Mutantenstamm von E. coli. Die Wachstumsrate der Zellen beeinflusst die Auftrittszeit der Kolonie. Wenn Kolonien wachsen mit der gleichen Geschwindigkeit kann der späte Auftreten zu der Verzögerungszeit (Fig. 7) zurückgeführt werden. Um zu überprüfen, dass die Methode tatsächlich misst die Verzögerungszeit von Einzelzellen verglichen wir ScanLag Ergebnisse mit den Ergebnissen Einzelzellmikroskopie; ist diese Prüfung abausführlich in einer früheren Publikation 7 ribed. Dieses Verfahren ermöglicht die Überwachung von viel mehr Zellen als mit Mikroskopie ausgewertet. Die Verwendung von Mikroskopie und mit ScanLag erhaltenen Ausschüttungen weitgehend überlappen. Die ScanLag Verteilung ist etwas breiter; theoretische Analysen vorhersagen Erweiterung in der Größenordnung der Standardabweichung der Teilung Zeit. Wenn Wachstumszeit ist für jeden Stamm, muß der Ursprung der Verzögerung in der Erscheinung weiter untersucht werden, die mit anderen Verfahren. Der Einfluss des frühen erscheinende Kolonien auf das Aussehen der Kolonien wurde später untersucht. Kontrollexperimente 7 bestätigt, dass spätere Aussehen so lange wie die Gesamtzahl der Kolonien pro Platte hat (Abbildung 8) nicht mehr als 200 nicht betroffen war. Ein weiteres Kontrollexperiment bestätigt, dass der Standort der Kolonie auf der Platte wurde sein Aussehen Zeit 7 nicht zu beeinträchtigen. Die Analyse des pneuste wird spezifischen Schwellenwerten, die eine Modifizierung in Abhängigkeit von Nährstoffen in Wachstumsmedium oder dem Typ des Mikroorganismus vorliegt benötigen kalibriert. Dennoch ist die Analyse für eine Vielzahl von Schwellenwerten ziemlich robust wie in Fig. 9 gezeigt. 1. Eine schematische Darstellung der Schritte, um eine Kolonie Aussehen Verteilung erstellen. Abbildung 2. Ein Screenshot der Geräte-Manager zeigt die Namen der angeschlossenen Scanner und der Konfigurationsdatei. Bitte klicken Sie hier ein, um zu vergrößernVersion dieser Figur. Ein Screenshot der Scan Manager Abbildung 3.. Abbildung 4. Ein Screenshot der ScanLagApp. Ein Bild der Platte ist auf der linken Seite, und die Wachstumskurven der einzelnen Kolonie sind auf der rechten Seite, wie in der Anleitung beschrieben. Die Spitzen in einigen Kolonien Bereich Kurven auftreten, wenn zwei oder mehr Kolonien zu verschmelzen. Beim Zusammenführen der Kolonien erfolgt, wird der Bereich dieser Kolonien als gemeinsames Gebiet betrachtet. 5. Ein repräsentatives Ergebnis der Analyse einer Platte. (A) Ein Bild von dem Ausgang der Erfassungsanwendung am Ende des Experiments. Jede Kolonie Bereich identifiziert wird, gefärbt und mit einer eindeutigen ID-Nummer zugewiesen. Die Pfeile zeigen auf repräsentative Kolonien in B. gemessen Die Kolonie wird auf der Grundlage Intensitätsschwelle erkannt (für E. coli-Kolonien auf LB-Agar-Agar oder M9 diese Schwelle beträgt 0,03. Für andere Medien oder Bakterien, diese Schwelle in den Funktions ProcessPictures eingestellt werden ). Nur Objekte über 10 Pixel gezählt (diese Schwelle in den Funktions MatchColonies geändert werden). Nachweis einer Kolonie beginnt bei etwa 10 5 Bakterien. (B) Grundstücke der Fläche in Pixeln gegenüber der Zeit von vier repräsentativen Kolonien in dieser Platte. Das "Aussehen Zeit" jeder Kolonie ist, wenn die Kolonie festgestellt wird. Die "Wachstumszeit" jeder Kolonie wird hier definiert als die Zeit, her wachsenm 20 Pixel auf 80 Pixel (diese Grenzen einstellbar mit der Funktion getAppearanceGrowthByVec sind). Die Software schließt die Kolonien, die vor dem Erreichen der oberen Grenze zusammengeführt. Identifizierung einer besonderen Kolonie nach seiner Eigenschaften ist einfach dank der Identifikationsnummer und die Farbe zu jeder Kolonie zugeordnet. Beispiels Kolonien # 1, 56, 77 und 124 sind in beiden Graphen hervorgehoben. Aussehen Quantifizierung Abbildung 6. Können bimodale Verteilung Verzögerungszeit offenbaren. Vergleich ScanLag Analyse Histogramme der Auftritt mal für zwei verschiedene Stämme. Blaue Linie: Wildtyp-Stamm wächst exponentiell (Gesamt: 1.320 Kolonien); rote Linie hohe Persistenz-Mutante mit hinkt Bakterien (Gesamt: 1.529 Kolonien) bereichert. (A) Normierte Histogramme Aussehen. Der Spitzendes Auftretens von exponentiell wachsenden Zellen ist die typische Zeit, um eine nachweisbare Kolonie wachsen. Einschub: gleiche Histogramm des Mutantenstammes nach Abzug der Zeitpunkt der Spitze der exponentiellen Kultur, um die tatsächliche Zeitverzögerung auf Log beabstandeten Fächern, die die Verzögerungszeit bimodale Verteilung zu erhalten. (B) Überlebensfunktion von den gleichen Daten wie in (A) auf einer logarithmischen Skala. Diese Darstellung verbessert die späte Auftreten Schwanz der Mutante. Figur 7. Aussehen Verteilung und Wachstum Zeitverteilung. (A) und (B) zeigen zweidimensionale Histogramm der Auftrittszeit und die Wachstumszeit der zwei unterschiedlichen Bedingungen (Die Software schließt Kolonien, die vor dem Erreichen der oberen Grenze zusammengeführt). (C) Vergleichen der Histogrammeder beiden Stämme zeigen den Unterschied im Aussehen der Zeit, während die Wachstumszeiten (D) ähnlich sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 8. Das Aussehen der frühen Kolonien nicht mit dem Aussehen des späteren Kolonien stören. (A) lag time Verteilung von Wildtyp-Zellen allein plattiert. (B) zurückbleiben Zeitverteilung eines kalten sensiblen Stamm allein, nach der Übertragung auf permissiven Temperatur. (C) zurückbleiben Zeitverteilung beider Stämme unter den gleichen Bedingungen zusammen plattiert. Die schwarze Linie stellt die erwartete Verteilung auf der Grundlage der Messung erhalten wird, wenn jeder Stamm separat Daten. Ein gut eingreement zwischen erwarteten und gemessenen Verteilungen ist, solange die Gesamtzahl der Kolonien pro Platte unter 200 erhalten. .. 9 der Detektionsschwelle beeinträchtigt nicht die Form der Kolonie Aussehen Verteilung Die Kolonie Aussehen Verteilung wurde für den gleichen Datensatz mit zwei verschiedenen Schwellengrößen analysiert; (A) Schwellengröße ist 10 Pixel; (B) Schwellengröße ist 50 Pixel. Anzahl der Zellen pro Histogramm: ca. 1500. Die unterschiedlichen Detektionsschwelle nur zu einer Verschiebung der Erfassungszeit. Abbildung 10. Temperaturstabilität Messungen across die Scanner-Oberfläche. (A) Bild von einer Platte mit Kolonien von Bacillus subtilis auf den Scanner ohne Power Management gewachsen. Die Oberfläche ist wärmer auf der Unterseite und damit die Kolonien wachsen schneller. Die schrittweise Linie neben der Platte ist eine schematische Darstellung der Wärmegefälle. (B) Die Temperaturstabilität wurde mit zwei Thermoelemente über die Scanner-Oberfläche platziert gemessen. Der Scanner erwärmt sich während jeder Abtastung und über die Zeit. (C) Mit Power Management ist die Temperatur gleichmäßiger und die Kolonien wachsen mit ähnlichen Raten. (D) wie (B) mit dem Power-Management-Modul. Temperaturkonstanz von ± 0.2 ° C. Abbildung 11. Unterschiede in der Erscheinung Verteilung kann durch di seinfferences in den Bänden von Festmedium. Das gleiche Bakterienkultur wurde auf Platten mit unterschiedlichen Volumina LB-Agar ausplattiert, was zu einer unterschiedlichen Höhe der Agaroberfläche. Die unterschiedlichen Höhen führte zu unterschiedlichen Opazität der Platten und damit eine andere Detektionszeit. Die Zwischenplatten Unterschied wurde geprüft, und die Differenz zwischen den verschiedenen Höhenbedingungen. (A) Typische Unterschiede zwischen den Platten gleicher Volumina von 30 ± 0,5 ml LB-Agar. (B) Unterschied zwischen den verschiedenen Höhenbedingungen: das Aussehen Verteilung für Platten mit einem Volumen von 20 ± 0,5 ml (rot) von 30 ± 0,5 ml (grün) und 40 ± 0,5 ml (blau) gemessen. Jede Bedingung ist der Durchschnitt von 6 verschiedenen Platten. Solange das Volumen der Platten innerhalb von ± 5 ml-Bereich, ist die Deckkraft ähnlich und führt ähnliche Erscheinung Zeitverteilung.