低酸素症後単一細胞レベルでのグローバルのRNA合成の分析

1。細胞培養および治療培養ヒト骨肉腫（U2OS）細胞に、表1に挙げた試薬や機器を収集します。全ての試薬を調製し、無菌性を保証するために、層流フード内のすべての組織培養技術を実施以下のように培養培地を準備し、10％（FCS）の最終濃度を達成するために、DMEM、50ミリリットルFCSを5mlのL-グルタミン、5mlのペニシリン/ストレプトマイシンを追加し、2 mMの（L-グルタミン）、50 U / mlの（ペニシリン）および50 U / mlの（ストレプトマイシン）。水浴中で37℃で培養液を温める。 治療用の細胞を準備します。 70％エタノール中でいくつかのカバースリップを殺菌、乾燥空気と6台の3.5 10cmプレートの底に1を配置することができます。 2ミリリットル中のカバーガラスを、彼らはウェルの底に付着したままであることを確実にするためにカバースリップピンセットで押し下げ、完全DMEM（37℃）を温め浸す。 それらの組織カルトからのU2OS細胞を切り離す4ミリリットルを印加3mlのPBSで一回洗浄することによりウレアプレートを0.05％トリプシン-EDTA（1％）を加温し、7分間37℃でインキュベートする。 6ミリリットルに再懸濁細胞を、トリプシン-EDTAを不活性化し、血球計数器を用いてカウントする完全DMEMを温めた。 1.3.1点で調製が3.5cmプレートの各プレートに2×10 5細胞。穏やかにさえ細胞分布を確実にするためにプレートを揺する。細胞が治療前に一晩を付着させる。 低酸素ワークステーションに4台の3.5 10cmプレートを配置することで細胞を処理し、通常の酸素条件下で、37℃のインキュベーター内で、他の2台の3.5 10cmプレートを残す。低酸素処理が終了する前に（低酸素処理された細胞のための低酸素室で）1時間処置した条件の下でRNA標識アッセイを開始する準備ができて。 1時間15分、1時間30分、2時間、および24時間低酸素状態に細胞​​を公開します。これらの時点は、柔軟でユーザーが決定している。 normoを使う陽性対照および陰性対照として4時間アクチノマイシンD（10μg/ mlの最終濃度）で処理した正常酸素3.5センチメートル板としてXIC 3.5センチメートルプレート。アクチノマイシンDは、グローバルなRNA合成の阻害剤である。 注意： ヘキスト33342は、既知の変異原物質である。 DMSOは、組織への有機分子の進入を容易にすることが知られている。 NaOHが腐食性である。 HClが腐食性である。 ホルムアルデヒドは、すべての動物に非常に毒性であり、ヒトに死を引き起こす可能性があります。 TRITON X-100は、直接接触後の皮膚刺激を引き起こす可能性があります。 皮膚に接触したり飲み込んだときアクチノマイシンDは有毒である。 すべての有害化学物質を取り扱う場合は、適切な予防措置をとる。 2。クリックイットアッセイ – 7.6、PBS中の3.7％パラホルムアルデヒド（PFA）、1％トリトンXリン酸緩衝生理食塩水（PBS）pH7.2で：文脈イットアッセイキットに加えて必要とされている以下の試薬を収集PBS、脱イオン水（のdH 2 O）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、10 M水 ​​酸化ナトリウム（NaOH）、および37％塩酸（HCl）-100;オプション – pH指示薬ストリップ。 次のようにクリックし、それを反応を行う前に、新鮮なPFA原液を準備します。 1.85グラムのPFA、50ミリリットルファルコンチューブに3.5ミリリットルのdH 2 OとのNaOH OF10 10μLを入れてください。水浴を行い、ドラフト内でこれを放置する電子レンジで大きなビーカー中のH 2 Oを400ミリリットル- 300を沸かす。 水浴中の50mlファルコンを置き、静かにPFAが溶解するまで定期的に蓋を解放する、10分間攪拌する。 37％の溶液が得られ、別の50mlのFalconチューブに0.2μmのフィルターを通してPFA溶液をシリンジ。 PBSを追加することで、この10倍希釈し、濃塩​​酸12μL程度添加することにより、6.8にpHを。オプション：ヒュームフード内のインジケーターストリップで正しいpHを確認してください。 すぐに使用したり、店舗O4℃でvernight 以下のように、RNAイメージングキットのストック溶液を準備します。 EUの100 mMのストック溶液を得コンポーネントAに373μlののdH 2 Oを追加します。最長1ヶ月間-20℃で保存してください。 コンポーネントB（アレクサフルーア594）に、DMSOの85μlを加え、ピペッティングまたはボルテックスで混和。最長1年間-20℃での両方を格納します。 RNAイメージングキットの反応バッファー添加剤の10倍液を作成するために、コンポーネントEに2ミリリットルのdH 2 Oを追加します。最長1年間-20℃で保存、溶液が褐色を開発する際に廃棄します。 EUとの細胞の標識：温めておいた完全培地（37℃）のステップ2.3で作成100 mMストックから、EUの2倍使用液を準備し、低酸素で処理した細胞のための低酸素室でこのステップとステップ2.5の残りの部分を実行します 。 メディア CONTにこの2倍使用液を等量加えることで1Xに希釈する細胞をaining。処理細胞培養条件下で1時間インキュベートする。 細胞固定：ウェルのPBSで一回ずつ洗浄し、処理条件の下で、上記のステップ2.2で作成3.7％PFAの株式の1ミリリットルを加える。処理条件の下で15分間インキュベートする。 低酸素状態で処理された試料は、この時点で、低酸素チャンバから除去することができる 。固定液を除去して（ 責任を持って、PFAの廃棄物を処分するように注意してください ）PBSで一回各ウェルを洗浄します。室温で次の手順を実行します。 透過処理：洗浄溶液を除去し、各ウェルにPBS中の1％のTriton X-100の1ミリリットルを加える。室温で15分間インキュベートする。透過化緩衝液を除去し、PBSで一回各ウェルを洗浄します。 標識されたRNA検出： のdH 2 Oで1:10（ステップ2.3で調製された）10倍液で希釈することにより、RNAイメージングキット反応緩衝添加物の新鮮な1Xワーキング溶液を調製します RNAイメージングキットを調製調製直後の使用のため、表2に従った反応カクテル。 洗浄溶液を除去し、各サンプルにRNAイメージングキットの反応カクテルを500μlを加える。室温で30分間インキュベートし、 光から保護します 。 RNAイメージングキットの反応カクテルを削除し、RNAイメージングキット反応リンス液（成分F）の1ミリリットルで1回洗浄し、RNAイメージングキットの反応リンスバッファを削除します。 オプションのマルチプレックス反応：製造業者の推奨に従って、この時点で、サンプルの追加の抗体標識を実行します。 DNA染色：PBSで洗浄サンプルはその後、洗浄溶液を除去。ヘキスト33342（成分G）PBS中で1:1,000に希釈します。各ウェルに希釈したヘキスト33342 1 mLを加え、室温で15分間インキュベートし、 光から保護する 。ヘキスト33342溶液を除去し、PBSで2回細胞を洗浄。洗浄solutioを削除Nおよび光学顕微鏡に進みます。 3。光学顕微鏡マウントカバーガラス： 標準的な顕微鏡スライドの中央に封入液10μlを置きます。 封入剤の一定量をカバーするために顕微鏡スライドの中央に細胞側でカバースリップを下に置きます。これは、後続の画像収集を不明瞭になるように封入剤中の気泡の発生を回避するように注意してください。 その周囲に明確なマニキュアを適用することにより、顕微鏡スライドにカバーガラスを貼り付けます。室温で5分間乾燥させます。 光から保護してください 。サンプルは、次の実装-20℃で保存してもよい。 画像取得：蛍光検出が可能な広視野顕微鏡を用いて画像を取得する。 DNAに結合したアレクサフルーア染料ヘキスト33342のおおよその蛍光/励起発光最大値を表3に示す。 パフォーマンスm個のイメージング40X/1.30 NA油浸レンズを使用して、冷却したCCDカメラで画像を取り込む。 4。データ解析従来OMEROクライアントにインポートする画像処理ソフトを用いてデコンボリューション画像（材料の表を参照）。他の全ての条件を制御正常酸素細胞からレンダリング設定を適用することによって、顕微鏡画像の可視化および解析ソフトウェアの同じ実験における全画像のレンダリングの設定を正規化する。 各画像から核を選択するには（材料の表を参照）顕微鏡画像の可視化と解析ソフトウェアにおける関心領域（ROI）ツールを使用します。各ROIのための平均強度を取得し、30〜50細胞との間の番号を含む、強度解析オプションを選択すると、各条件の平均値と標準偏差を計算します。 ステップ4.2トンで得られたすべての個々の平均強度値をプロットしたデータのグラフ作成ソフトウェア（材料表を参照）を使用して散布図を構築O各条件下で細胞間の変動を反映している。代替的に、平均強度の平均プラス新生RNAの標準偏差を表すための棒グラフを構成する。