Juxtasomal Biocytin תיוג לחקר קשר בין מבנה לתפקוד של פרט נוירונים קליפתיים
Summary
כדי להבין את המבנה של רשתות נוירונים, אפיון פונקציונלי וצורני של נוירונים בודדים הוא הכרח. הנה, אנחנו מדגימים תיוג juxtasomal biocytin, המאפשר הקלטות אלקטרו בתצורה תאית, ועם זאת שמירה על היכולת לתייג את הנוירון לפוסט הוק שחזור של הדנדריטים ואדריכלות אקסון intracellularly.
Abstract
קליפת המוח מאופיין במספר רב של שכבות והרבה תאים מסוגים שונים שיחד כרשת אחראים להרבה תפקודים קוגניטיביים גבוהים יותר כולל קבלת החלטות, התנהגות מודרכת חושית או זיכרון. כדי להבין כיצד רשתות עצביות סבוכות כזה לבצע משימות כאלה, בצעד מכריע הוא לקבוע את הפונקציה (או פעילות חשמלית) של סוגי תאים בודדים בתוך הרשת, מעדיף כאשר החיה היא ביצוע משימה קוגניטיבית רלוונטית. בנוסף, הוא חשוב באותה מידה כדי לקבוע את המבנה האנטומי של הרשת והארכיטקטורה מורפולוגי של נוירונים הבודדים כדי לאפשר להנדסה הפוכה הרשת בקליפת המוח. פריצות דרך טכניות הזמינים כיום מאפשרות הקלטת פעילות סלולרית בערים, מתנהגת בעלי חיים עם האפשרות היקר של פוסט הוק זיהוי נוירונים המוקלטים. הנה, אנחנו מדגימים את טכניקת תיוג biocytin juxtasomal, הכוללת potenti פעולת הקלטהאל יוצרות עלייה חד בתצורה (-התיקון רופף או) תאי באמצעות טפטפות תיקון קונבנציונלית. תצורת הקלטת juxtasomal היא יציבה יחסית והחלים על פני תנאים התנהגותיים, הכולל הרדמה, תרופות הרגעה, קבוע בראש, ואפילו בערים בעלי החיים לנוע בחופשיות. לכן, שיטה זו מאפשרת קישור spiking פוטנציאל פעולת תאים מסוג מסוים בהתנהגות בעלי חיים לשחזור של נוירונים הבודדים וסופו של דבר, microcircuit קליפת המוח כולו. בכתב יד הסרטון הזה, אנו מראים כיצד יכולים להיות מתויגים נוירונים בודדים בתצורת juxtasomal עם biocytin בעכברים מורדם urethane לפוסט הוק זיהוי ושחזור מורפולוגיים.
Introduction
רשתות עצביות מורכבות של סוגי תאים מרובים, מאופיינים בתכונות מורפולוגיות ופיזיולוגיות מאוד ספציפיות 1-7. כתוצאה מכך, סוגי תאים בודדים לבצע משימות מיוחדות בתוך הרשת (ראה למשל Gentet et al. 8 וBurgalossi et al. 9). אנחנו רק מתחילים להבין פונקציות ספציפיות לסוג תא ברשתות עצביות ועוד ועדיין לא התגלה. לשם כך, במעבדות רבות ביישום גישות ניסיוניות המאפשרות הניתוח של מאפיינים צורניים של אותה האוכלוסייה העצבית שממנו הפרמטרים פיסיולוגיים התקבלו 1,10-15. הנה, אנחנו מדגימים את טכניקת תיוג juxtasomal 16,17 הכוללת קלטות אלקטרו באמצעות טפטפות תיקון קונבנציונלית בתצורה תאית (ובכך פולשני) בשילוב עם electroporation של נוירון שהוקלט עם biocytin.יתרון עיקרי של גישה זו הוא שהטבע לא פולשנית מבטיח כי spiking פוטנציאל פעולה של נוירונים בודדים נרשם מבלי לשנות (למשל dialyzing) התוכן תאיים של התא. ואחריו electroporation, גישת juxtasomal מספקת את האפשרות של הודעה זיהוי תא הוק ושחזור לקשר תפקוד (פיזיולוגיה) למבנה (מורפולוגיה). בדרך כלל, שיקום מורפולוגיים כרוך שחזור של מורפולוגיה הדנדריטים ואקסון אשר יכול להתארך לכימות של צפיפות עמוד השדרה ו / או בוטון או אפילו שחזור של מורפולוגיה עצבית ברזולוציה ננומטר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים. טכניקת הקלטת juxtasomal יכולה לשמש לin vivo הקלטות של תאים מסוגים שונים על פני שכבות בקליפת המוח או באזורים תת קליפת המוח במגוון של מינים, למרות שרוב המחקרים ליישם את הטכניקה במכרסמים קטנים כגון עכברים או חולדות. בהקלטת ותיוג נוירונים המחקר שלנו מתמקדמקליפה החושית העיקרית עכברוש (S1) וכרוך בזיהוי חזותי של נוירונים נרשמו 18, שחזורים דנדריטים בשילוב עם רישום מדויק במסגרת התייחסות אחידה ללהנדס לאחור רשתות קליפת המוח 4,19 ושחזור מפורט של אדריכלות אקסון לאפיין סוג התא ספציפי מקומי ותחזית לטווח ארוך מטרות 20.
בהשוואה לin vivo טכניקות חלופיות הקלטה (תאית או כל תא), הקלטות juxtasomal הן יציבים יחסית, ולכן יכולות להיות מיושמות על פני מדינות התנהגותיות כוללים 21,22 מורדם, מסוממת 14, בעלי חיים 23 אפילו באופן חופשי הנעים קבוע בראש, או ער 9 . כאן, אנו מציגים תיוג juxtasomal בS1 של עכברוש הרדים urethane, אם כי אנו מדגישים את תחולתה הכללית של טכניקה זו כדי הכנות רבות של בחירה.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטת juxtasomal מאפשרת הקלטה בspiking פוטנציאל פעולת vivo מיחידות בודדות על פני תנאים התנהגותיים (בהרדמה, ער או באופן חופשי לנוע קבוע בראש) עם האפשרות של נוירון שנרשם לפוסט סיווג סוג תא הוק ו / או שחזור 3D תיוג-biocytin. היתרון העיקרי הוא להשיג פרמטרים פיסיולוגיים …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לפרופ. Huibert Mansvelder וברט Sakmann לתמיכה נרחבת, ד"ר מרסל Oberlaender לדיונים פוריים ומתן מעקב עצבי, וברנדן Lodder לקבלת סיוע טכני. הנתונים נרכשו באמצעות ntrode השישי לLabView, סיפק בנדיבות על ידי ר 'ברונו (קולומביה Univ., ניו יורק, ארה"ב). מחקר זה נתמך על ידי אגודת מקס פלאנק והמרכז ברנשטיין לחישובית Neuroscience, טובינגן (ממומן על ידי המשרד הפדרלי הגרמני לחינוך ולמחקר (BMBF; FKZ: 01GQ1002)) (RTN), מרכז לNeurogenomics ומחקר קוגניטיבי (CNCR) , מדעי המוח הקמפוס אמסטרדם (NCA), מימון לCPJdK (NWO-alw # 822.02.013 ו# p3-C3 ENC-רשת) וVU באוניברסיטת אמסטרדם.
Materials
| SM-6 control system | Luigs & Neumann | ||
| LN- Mini 23 XYZ | |||
| LN- Mini 55 Manipulatorblock X2 | |||
| Lynx-8 amplifier | Neuralynx | ||
| Axoclamp-2B amplifier | Axon Instruments | ||
| Osada model EXL-M40 | Osada, inc. | ||
| Piezoelectric device | Physik Instrumente | PL140.10 | |
| Labview | National Instruments, Austin, TX, USA | ||
| Ntrode Virtual Instrument | R. Bruno, Columbia Univ., NY, USA | ||
| (Labview acq. software) | |||
| Sugi absorbent swabs | Kettenbach | 30601 | |
| Cytochrome C from equine heart | Sigma | C2506 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma | C9322 | |
| DAB | Sigma | D5637 | |
| H2O2 | Boom | 7047 | |
| Vectastain standard ABC-kit | Vector | PK6100 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Isoflurane | Pharmachemie | 45.112.110 | |
| Lidocaine | Sigma | L5647 | |
| Simplex rapid dental cement | Kemdent | ACR308/ACR924 | |
| Biocytin | Molekula | 36219518 | |
| PFA | Merck Millipore | 8187151000 | |
| Trizma base | Sigma | T4661 | |
| Mowiol 4-88 | Aldrich | 81381 | |
| Analytical grade glycerol | Fluka | 49767 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 31434 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60130 | |
| CaCl | Sigma Aldrich | 22,350-6 | |
| MgCl2 | Fluka | 63072 |
References
- Brown, S. P., Hestrin, S. Cell-type identity: a key to unlocking the function of neocortical circuits. Curr. Opin. Neurobiol. 19 (4), 415-421 (2009).
- DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nat. Rev. Neurosci. 14 (3), 202-216 (2013).
- Dean, P., Porrill, J., Ekerot, C. F., Jorntell, H. The cerebellar microcircuit as an adaptive filter: experimental and computational evidence. Nat. Rev. Neurosci. 11 (1), 30-43 (2010).
- Oberlaender, M., et al. Cell type-specific three-dimensional structure of thalamocortical circuits in a column of rat vibrissal cortex. Cereb. Cortex. 22 (10), 2375-2391 (2012).
- Dyer, M. A., Cepko, C. L. Regulating proliferation during retinal development. Nat. Rev. Neurosci. 2 (5), 333-342 (2001).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
- Urban, N., Tripathy, S. Neuroscience: Circuits drive cell diversity. Nature. 488 (7411), 289-290 (2012).
- Gentet, L. J., et al. Unique functional properties of somatostatin-expressing GABAergic neurons in mouse barrel cortex. Nat. Neurosci. 15 (4), 607-612 (2012).
- Burgalossi, A., et al. Microcircuits of functionally identified neurons in the rat medial entorhinal cortex. Neuron. 70 (4), 773-786 (2011).
- Bock, D. D., et al. Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons. Nature. 471 (7337), 177-182 (2011).
- Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471 (7337), 183-188 (2011).
- Herfst, L., et al. Friction-based stabilization of juxtacellular recordings in freely moving rats. J. Neurophysiol. 108 (2), 697-707 (2012).
- Marx, M., Gunter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat. Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
- Bruno, R. M., Sakmann, B. Cortex is driven by weak but synchronously active thalamocortical synapses. Science. 312 (5780), 1622-1627 (2006).
- Oberlaender, M., Ramirez, A., Bruno, R. M. Sensory experience restructures thalamocortical axons during adulthood. Neuron. 74 (4), 648-655 (2012).
- Joshi, S., Hawken, M. J. Loose-patch-juxtacellular recording in vivo-a method for functional characterization and labeling of neurons in macaque V1. J. Neurosci. Methods. 156 (1-2), 37-49 (2006).
- Pinault, D. A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin. J. Neurosci. Methods. 65 (2), 113-136 (1996).
- de Kock, C. P., Bruno, R. M., Spors, H., Sakmann, B. Layer and cell type specific suprathreshold stimulus representation in primary somatosensory cortex. J. Physiol. 581 (1), 139-154 (2007).
- Egger, R., Narayanan, R. T., Helmstaedter, M., de Kock, C. P., Oberlaender, M. 3D reconstruction and standardization of the rat vibrissal cortex for precise registration of single neuron morphology. PLoS Comput. Biol. 8 (12), (2012).
- Oberlaender, M., et al. Three-dimensional axon morphologies of individual layer 5 neurons indicate cell type-specific intracortical pathways for whisker motion and. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (10), 4188-4193 (2011).
- Sakata, S., Harris, K. D. Laminar structure of spontaneous and sensory-evoked population activity in auditory cortex. Neuron. 64 (3), 404-418 (2009).
- de Kock, C. P., Sakmann, B. High frequency action potential bursts (>or= 100 Hz) in L2/3 and L5B thick tufted neurons in anaesthetized and awake rat primary somatosensory cortex. J. Physiol. 586 (14), 3353-3364 (2008).
- de Kock, C. P., Sakmann, B. Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (38), 16446-16450 (2009).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Horikawa, K., Armstrong, W. E. A versatile means of intracellular labeling: injection of biocytin and its detection with avidin conjugates. J. Neurosci. Methods. 25 (1), 1-11 (1988).
- O’Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67 (6), 1048-1061 (2010).
- Veinante, P., Deschenes, M. Single-cell study of motor cortex projections to the barrel field in rats. J. Comp. Neurol. 464 (1), 98-103 (2003).
- Boudewijns, Z. S., et al. Layer-specific high-frequency action potential spiking in the prefrontal cortex of awake rats. Front. Cell. Neurosci. 7, 99 (2013).
- Oberlaender, M., Bruno, R. M., Sakmann, B., Broser, P. J. Transmitted light brightfield mosaic microscopy for three-dimensional tracing of single neuron morphology. J. Biomed. Opt. 12 (6), 064029 (2007).
- Boudewijns, Z. S., et al. Semi-automated three-dimensional reconstructions of individual neurons reveal cell type-specific circuits in cortex. Commun. Integr. Biol. 4 (4), 486-488 (2011).
- Bruno, R. M., Hahn, T. T., Wallace, D. J., de Kock, C. P., Sakmann, B. Sensory experience alters specific branches of individual corticocortical axons during development. J. Neurosci. 29 (10), 3172-3181 (2009).
- Schubert, D. Observing without disturbing: how different cortical neuron classes represent tactile stimuli. J. Physiol. 581 (1), 5 (2007).
- Neumann, E., Kakorin, S., Toensing, K. Fundamentals of electroporative delivery of drugs and genes). Bioelectrochem. Bioenerg. 48 (1), 3-16 (1999).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
