Yenidoğan Kemirgenlerin Ventral Kafatası kranyotomi olun Bir Yöntem
Summary
Bir cerrahi yöntem, yeni doğmuş sıçanlarda ventral kafatasını açığa çıkarmak için tarif edilmektedir. Bu yaklaşımı kullanarak bu anestezi yavruların beyin sapı akut elektrofizyoloji ve iki-foton mikroskopi deneylerini gerçekleştirmek için bir kraniotomi açmak mümkündür.
Abstract
In vivo deneyler için bir kranyotomi kullanılması erişkin memeli beyninde ve gelişme sırasında çeşitli hücresel süreçlerin dinamiklerini araştırmak için bir fırsat sağlar. Çoğu in vivo yaklaşımlar sırt tarafında bulunan beyin bölgelerini incelemek için kranyotomi kullanmalarına rağmen, bu tür ventral tarafında bulunan pons, gibi beyin bölgeleri nispeten ilgili yeterli kalır. Bu protokolün ana amacı, elektrofizyolojik ve görüntüleme yöntemleri kullanılarak in vivo okudu böylece ventral beyinsapı yapılarının erişimi kolaylaştırmaktır. Bu yaklaşım sağlar yapısal uzun menzilli akson değişiklikler, tek bir elektriksel aktivite desen ve hücrelerin topluluklar ve yenidoğan hayvanlarda kan beyin bariyeri geçirgenliğinin değişikliklerin çalışma. Bu protokol, yeni doğmuş sıçanlarda beyin sapı işitsel çalışma için en çok kullanılmış olmasına rağmen, bu tür kolay yeni doğmuş farelerde, yetişkin Roden gibi diğer kemirgen türlerde çalışmalar için uyarlanabilirts ve diğer beyin bölgeleri.
Introduction
Flüoresan görüntüleme ve elektrofizyoloji teknikleri ile kombinasyon halinde bir kranyotomi kullanılması izleme sağlar: kan akımı, kan-beyin bariyeri geçirgenliğinin ve canlı hayvan 1-3 nöron ve glial hücrelerin aktivitesinin ölçülmesi. Çeşitli laboratuarlar sağlıklı ve hastalık durumlarında beyin fizyolojisi içgörü sağlamak için bu yaklaşımı kullanmış, ancak boşluklar bu süreçlerin gelişimi sırasında ortaya nasıl anlayışımıza kalır. Ayrıca, çalışmaların çoğu çeşitli fizyolojik rolleri ile ventral beyin sapı yapıları ex vivo yaklaşımlar kullanılarak çoğunlukla çalışılmıştır şekilde, kolayca kafatasının dorsal yüzeyinden erişilebilir beyin bölgelerinde odaklanmıştır.
Bu protokol ana amacı kemirgen ventral kafatası kranyotomi açılması için bir yöntem sağlamaktır. Bu yaklaşım, duyusal neurophysiology reco için köpek ve kedi gibi daha büyük memelilerde gerçekleştirilen klasik çalışmalar uyarlanmıştırişitsel beyin sapı 4-7 rdings. Bu protokolde Ancak, yenidoğan hayvanlarda prosedürü yerine yeni bir meydan okuma vardır. Damar işaretlerini kullanarak, bu adapte protokol yenidoğan sıçanlar, yetişkin farelerin ve alt zeytin 8-11 (Şekil 1) gibi diğer beyin sapı bölgelerin işitsel beyin sapı incelemek için önceden kullanılan olmuştur.
Ventral beyin sapı çekirdekleri çalışma mevcut yöntemlere göre bir ventral kranyotomi bir ana avantajı yaşayan hayvanlar ilgi yapılarına doğrudan erişim sağlamasıdır. Örneğin, üstün olivary kompleksinin işitsel hücreleri probları hedef yerleştirilmesi için ve görüntüleme derinliği 0,5 mm ile sınırlı hangi iki foton görüntüleme yaklaşımlar kullanılarak için önemli olan beyin yüzeyinden mikrometre arasında birkaç on lokalizedir Hafif doku saçılma ve soğurma. Bir ventral kraniotomi de wh, nispeten bozulmamış sinirsel bağlantıları ile bir hazırlık sağlar,ich akut ve organotipik dilim hazırlıkları 12 bozulur. In vivo deneyler neurophysiology 13 için diğer protokollere aksine, ventral bir yaklaşım, çok elektrot kayıt ve hücre toplulukları hakkında bilgi görüntüleme yöntemleri ile kombine edilebilir (Şekil 6 ve 7). Son olarak, bu protokol ile kombinasyon halinde bir floresan işaretli çözünen çözünen için, kan-beyin bariyeri geçirgenliğinin değişiklikleri (Şekil 8) ölçmek için damar enjekte edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zaman kritiktir. Deneyimli bir araştırmacı (1-3 adım) 1 saat içinde bu protokol tamamlamak gerekir. Farklı adımları için belirtilen süreleri uzmanlık düzeyi yüksek bir orta varsayalım. Yoksul havalandırma kontrol hayvanın boğulma ve ölüme yol açabilir beri doğru ve zamanında trakeostomi ve entübasyon, önemlidir. Hatalar hayvanın kontrolsüz kanama ve ölüme yol açabilir, çünkü kas ve yağ dokularının dikkatli açıklık da çok önemlidir. Kanül yerleştirilmesi için karotis arter hazırlarken Benzer şekilde, bir iplik düğüm gevşek olursa kontrolsüz kanama gerçekleşecek, dikkatle arter sıkın ve kesmek gerekir. Son olarak, kraniotomi damarsal işaretlerini aksatmadan, dikkatle yapılmalıdır. Dış meningeal tabakası (dura) dikkatsiz çıkarılması şiddetli kanama ve arteriyel arz hasara yol açabilir.
Havalandırma ayarları hayvanın yaşına göre seçilir.Çoğu ticari tedarikçiler gibi ayarları hakkında yararlı bilgiler sağlar. P15 daha yaşlı farelerde deneyler büyük bir hayvan vantilatörü kullanımını gerektirecektir. Ergin hayvanlar ketamin / ksilazin ile anestezi eğer havalandırma ihtiyacı olmayabilir, ancak entübasyon trakea giren sıvıyı önlemek için tavsiye edilir.
Bu protokolün bir ana sınırlama deneyleri sadece akut gerçekleştirilebilir olmasıdır. Laboratuarımızda iki ve on kadar saat arasında süren deneyler var. İkinci bir sınırlama deneyleri anestezi altında yapılabilir zorunda olmasıdır. Bu nedenle, anestezik seçimi deneylerin planlanması ve tasarımında dikkate almak önemli bir değişkendir. Bununla ilgili bir konu yenidoğan hayvanlar doz aşımı özellikle hassas olmasıdır. Örneğin, ketamin / ksilazin karışımı seçimi ise, yavru ağırlığına göre dozu hesaplamak ve maksimum hacim ⅓ da ilaçlar yönetmek. Ayak tutam r tarafından her 5-10 dakikada hayvanın durumunu kontrol edinesponse. Izofluran kullanıyorsanız, önlemler aynı zamanda araştırmacı (uygun havalandırma ve düzgün kalibre buharlaştırıcı) için güvenli bir ortam sağlamak için gereklidir.
Stereomikroskop iki foton mikroskop için elektrotlar ve hayvanın taşınması yer görüş açısını ayarlamak ve alan açıklık kolaylaştırmak için esnek bir tutucu üzerine monte edilebilir. Ventilatöre güç bir pil kullanın hayvan hareket kolaylaştırmak ve elektrofizyoloji deneyleri sırasında elektrik eserler azaltabilir. Bu amaçla, bir küçük breadboard (7.5 x 12 inç) ventilatör, ısıtma yastığı ile anestezi uygulanmış hayvan (Şekil 2a) birlikte monte etmek için kullanılabilir. Bu kurulum için yararlı ve önemli bir değişiklik ameliyat sırasında vital işaretler izlenmesi için bir cihaz eklenmesidir. Bir oksimetre veya diğer analog cihazların laboratuvar bütçesine bağlı olarak kullanılabilir.
Bu protokol elektrofizyoloji ve araya görüntüleme ile kullanılır olmuşturpatch clamp kayıtları 8,10,11, polytrode kayıtları (Şekil 7) ve iki foton görüntüleme de dahil olmak üzere 9 hods, (Şekil 6 ve 8). Bir gelecekteki olası uygulama elektrofizyolojik kayıt 16 için floresan etiketli hücreleri hedef için bu yöntemleri birleştirmek olacaktır.
Yeni görüntüleme uygulamalar da 2-D veya iki-foton mikroskopi kullanılarak 3-D zaman serisi içerebilir. Örneğin, beyin nöronal ve glial hücre popülasyonlarının aktivitesini incelemek için kalsiyum göstergelerin bolus yükleme kullanılarak. Şekil 8'de gösterildiği gibi, bir boya çözeltisi karotid arteri yoluyla kan dolaşımı içine enjekte edilen beyin damar yüksek kontrast görüntüleri üretmek için kullanılabilir. Floresan boya mikro damar lümeni doldurur ve çevredeki dokuya yayılır, bu eriyik difüzyon katsayısı, kan-beyin bariyerinin geçirgenliğinin belirgin çözünen hesaplamak için değil, aynı zamanda kullanılabilirbeyin dokusunda 3 ficient. Karotid arter yoluyla floresan etiketli çözünmüş enjekte edilmesi için bir ana nedeni, boya çözeltisi doğrudan bir kuyruk damarından enjeksiyon ilk olarak kalp gitmeden beyindeki kılcal gitmek olabilir. Bu, en azından iki avantajı getirir. Bir perfüzyon oranı kanülasyon yerinde sabit ise mikrodamar lümeninde floresan boya konsantrasyonu, hemen hemen sabit olmasıdır. Bu, kan-beyin bariyeri geçirgenliğinin doğru belirlenmesini sağlar. Başka bir test maddesi Perfüzat dahil olması durumunda, doğrudan vücut dolaşımdan diğer faktörler ile seyreltildi ve kombine edilmeden, kan-beyin bariyeri gidecek olmasıdır.
Yeni deneyler de genetik olarak kodlanmış floresan gazetecilere transgenik hayvanların yararlanabilir. Bu (floresan probları yerinde yüklenmesine gerek olmaz olanaklar sağlayacak sürece Deneyin tasarımızaman tasarrufu ve muhtemelen daha sağlam hazırlıkları (örn. kafa penceresi 17) için izin) olarak belirtiyor.
Son olarak, deneyler bu tür alt zeytin ya da yüz motor çekirdeği gibi diğer beyin bölgelerinde yapılabilir. Belirli bir türün belirli hücresel popülasyonların Nöroanatomisinin ve gelişimi hakkında bilgiler anatomik oluşumlar hayvanlar (Şekil 1) büyüdükçe değişebilir özellikle de, bu amaca yönelik önemli olacaktır. Biz bu protokol vivo elektrofizyolojik ve görüntüleme yöntemleri kullanılarak ventral beyin sapı yapıları incelemek için başkalarını teşvik umuyoruz.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH / NCRR / RCMI hibe G12-RR003060 tarafından desteklenen, Yeni Şehir Üniversitesi Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi, Ulusal Bilim Vakfı CBET 0754158 ve PSC-CUNY 62337-00 40 Eunice Shriver Ulusal Enstitüsü SC1HD068129 hibe York.
Materials
| Absorbant pads | Kettenbach | Sugi 31603 | Other options may be available from different companies |
| Cautery | Braintree Scientific, INC | GEM 5917 | Other options may be available from different companies |
| Tetramethyl rhodamine Isothiocyanate dextran | Sigma | T1287-500MG | Other options may be available from different companies |
| Dissecting Chisel | Fine Science Tools | 10095-12 | Other options may be available from different companies |
| DiI | Invitrogen | V-22885 | Other options may be available from different companies |
| Elastomer | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Other options may be available from different companies |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | Other options may be available from different companies |
| Forceps | Fine Science Tools | 11027-12,11617-12, 11616-16 | Other options may be available from different companies |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15009-08 | Other options may be available from different companies |
| Heating pad | FHC | 40-90-2 | Other options may be available from different companies |
| Intubation tubing | Braintree Scientific, INC | BIO CO-KIT | Choose age appropriate size |
| Light source | Spach Optics | Schott Ace illuminator | Other options may be available from different companies |
| Micro drill | Braintree Scientific, INC | MD-1200 120V | Other options may be available from different companies |
| Paper tape | Walgreens | Generic brand | Other options may be available from different companies |
| Syringe filter | VWR | 28145-483 | Other options may be available from different companies |
| Syringe pump | VWR | 52459-008 | Other options may be available from different companies |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | Other options may be available from different companies |
| Suture | Ethicon | Prolene 86979 | 6-0 size |
| Tubing | Braintree Scientific, INC | Micro-Renathane (MRE033); SUBL-120 | Other options depending on pup’s age |
| Vaporizer (isoflurane) | Vetequip Incorporated | 911103 | Other options may be available from different companies |
| Ventilator (minivent) | Harvard Apparatus | 730043 | Use for P0-P12 rats |
References
- Kerr, J. N. D., Denk, W. Imaging in vivo: watching the brain in action. Nat. Rev. Neurosci. 9 (3), 195-205 (2008).
- Sigler, A., Murphy, T. H. In vivo 2-photon imaging of fine structure in the rodent brain: before, during, and after stroke. Stroke. 41 (10), 117-123 (2010).
- Shi, L., Zeng, M., Sun, Y., Fu, B. M. Quantification of blood-brain barrier solute permeability and brain transport by multiphoton microscopy. ASME J. of Biomech. Eng. 136 (3), 031005-031005 (2014).
- Galambos, R., Schwartzkopff, J., Rupert, A. Microelectrode study of superior olivary nuclei. Am. J. Physiol. 197, 527-536 (1959).
- Goldberg, J., Brown, P. B. Response of binaural neurons of dog superior olivary complex to dichotic tonal stimuli: some physiological mechanisms of sound localization. J. Neurophysiol. 32 (4), 613-636 (1969).
- Guinan, J. J., Guinan, S. S., Norris, B. E. Single auditory units in the superior olivary complex I: responses to sounds and classifications based on physiological properties. Intern. J. Neurosci. 4, 101-120 (1972).
- Spirou, G. A., Brownell, W. E., Zidanic, M. Recordings from cat trapezoid body and HRP labeling of globular bushy cell axons. J. Neurophysiol. 63 (5), 1169-1190 (1990).
- Khosrovani, S., Der Giessen, R. S. V. a. n., De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. In vivo mouse inferior olive neurons exhibit heterogeneous subthreshold oscillations and spiking patterns. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (40), 15911-15916 (2007).
- Rodríguez-Contreras, A., Van Hoeve, J. S., Habets, R. L., Locher, H., Borst, J. G. G. Dynamic development of the calyx of Held synapse. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (14), 5603-5608 (2008).
- Lorteije, J. A., Rusu, S. I., Kushmerick, C., Borst, J. G. G. Reliability and precision of the mouse calyx of Held synapse. J. Neurosci. 29 (44), 13770-13784 (2009).
- Tritsch, N. X., Rodríguez-Contreras, A., Crins, T. T., Wang, H. C., Borst, J. G. G., Bergles, D. E. Calcium action potentials in hair cells pattern auditory neuron activity before hearing onset. Nat. Neurosci. 13 (9), 1050-1052 (2010).
- Tong, H., Steinert, J. R., Robinson, S. W., Chernova, T., Read, D. J., Oliver, D. L., Forsythe, I. D. Regulation of Kv channel expression and neuronal excitability in rat medial nucleus of the trapezoid body maintained in organotypic culture. J. Physiol. 588 (9), 1451-1468 (2010).
- Sonntag, M., Englitz, B., Kopp-Scheinpflug, C., Rübsamen, R. Early postnatal development of spontaneous and acoustically evoked discharge activity of principal cells of the medial nucleus of the trapezoid body: an in vivo study in mice). J. Neurosci. 29 (30), 9510-9520 (2008).
- García-Villalón, A. L., Roda, J. M., Alvarez, F., Gómez, B., Diéguez, G. Carotid blood flow in anesthetized rats: effects of carotid ligation and anastomosis. Microsurgery. 13 (5), 258-261 (1992).
- Yuan, W., Lv, Y., Zeng, M., Fu, B. M. Non-invasive method for the measurement of solute permeability of rat pial microvessels. Microvasc. Res. 77 (2), 166-173 (2009).
- Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Haüsser, M. Targeted patch-clamp recordings and single-cell electroporation of unlabeled neurons in vivo. Nat. Methods. 5 (1), 61-67 (2008).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window. J. Vis. Exp. (12), (2008).
