باستخدام الحمض النووي الريبي التدخل للتحقيق في الاستجابة المناعية الفطرية في الفأر الضامة
Summary
In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.
Abstract
Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.
Introduction
في هذا البروتوكول، ونحن تصف أساليب فعالة لكبح الجينات في خطوط خلايا البلاعم الماوس باستخدام الرناوات siRNAs ورصد آثار هذه العلاجات على الاستجابة المناعية الفطرية. يتم تنفيذ هذه الإجراءات في شكل 96-جيدا، مما يسمح للشاشات رني في متوسطة أو عالية الإنتاجية الموضة.
ردا على إصابة البشر جبل الاستجابة المناعية الفطرية الفورية واستجابة أبطأ ولكن أكثر تحديدا المناعة التكيفية. وتتضمن هذه الاستجابة المناعية الفطرية السريعة تجنيد وتنشيط الخلايا المناعية الفطرية أكلة بما في ذلك الضامة 1. وتشارك الضامة تفعيلها كلاسيكي في الاستجابات الالتهابية الحادة وتنتج البروتينات المضادة للميكروبات والمركبات، والسيتوكينات كيموكينات، ومستضدات موجودة 2،3. الضامة تفعيلها بدلا من ذلك تلعب دورا في تنظيم الحصانة، والحفاظ على التسامح وإصلاح الأنسجة والتئام الجروح 4-8. بسبب طائفة واسعة من الوظائف الخاصةيمكن الضامة تلعب دورا في العديد من الأمراض بما في ذلك تصلب الشرايين والتهاب المفاصل والسرطان 9. وبالتالي، فإن دراسة الضامة مجالا رئيسيا للبحوث لبعض الوقت في طائفة واسعة من المجالات المرض.
على الرغم من أهميتها في الاستجابة المناعية الفطرية، الضامة يمكن أن يكون تحديا خلايا للعمل مع. على وجه الخصوص، فمن الصعب الحصول على ترنسفكأيشن كفاءة استخدام الكواشف الدهون في الضامة دون سمية المرتبطة 10،11. وعلاوة على ذلك، حتى عندما يتم تسليم سيرنا بكفاءة لالضامة، متانة الجين رني الناجم عن ضربة قاضية في كثير من الأحيان يمكن أن يكون معتدلا إلى حد ما ويمكن أن تختلف من الجينات إلى الجين.
للتغلب على هذه التحديات التقنية، قمنا الأمثل ترنسفكأيشن وتقنيات ضربة قاضية 12-16 في اثنين من خطوط الخلايا الماوس بلعم، RAW264.7 17 و 18 J774A.1. يستخدم هذا النهج AMAXA Nucleofector 96-جيدا نظام المكوك لترنسفكأيشن. هذا النظاميستخدم مزيجا من المواد الكيميائية المتخصصة و electroporation لبالنقل الخلايا في شكل 96-جيدا 19. بعد ترنسفكأيشن، نحن تصف الأساليب لتعظيم الانتعاش الخلايا وقدرتها على البقاء وتعظيم اللاحقة التي يسببها سيرنا ضربة قاضية الجينات. لتوضيح فائدة هذا النهج، نحن تصف بروتوكول للتسليم سيرنا على هذه السطور خلية بلعم، وتحفيز هذه الخلايا مع عديد السكاريد الشحمي (بي إس)، ومراقبة الاستجابة المناعية الفطرية على مستوى إنتاج العديد من السيتوكينات الموالية للالتهابات. نحن نقدم بيانات العينة التي نعمل استهداف تول مثل مستقبلات (TLR) عائلة، أفرادها الشعور LPS والممرض المرتبطة أنماط الجزيئية الأخرى (PAMPs)، لتنظيم المناعة الفطرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد نشرت العديد من الدراسات التي تم فيها استهداف الجينات الفردية عن طريق سيرنا في الضامة الفئران. بينما الدهون بوساطة ترنسفكأيشن تم استخدامها لتقديم سيرنا على خطوط خلايا البلاعم على أساس فردي، وهذه الأساليب تعاني من الآثار المحتملة على قدرتها على البقاء، ضربة قاضي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Thanks to Brad Lackford for assistance optimizing some of the techniques described in this manuscript.
Materials
| Amaxa nucleofector 96-well shuttle system | Lonza | AAM-1001S | |
| Amaxa SF cell line 96-well nucleofector kit | Lonza | V4SC-2096 | |
| RAW264.7 mouse macrophage cell line | ATCC | TIB-71 | |
| J774A.1 mouse macrophage cell line | ATCC | TIB-67 | |
| siGenome smartpool siRNA | Dharmacon | varies depending on gene | |
| Non-targeting control siRNA pool | Dharmacon | D-001206-13-20 | |
| Block-iT fluorescent oligo for electrooration | Invitrogen | 13750062 | |
| Ultrapure E. coli O111:B4 LPS | List Biological Laboratories | 421 | |
| DMEM, high glucose | Invitrogen | 11995-065 | |
| RPM1-1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution (Pen/Strep) | Fisher | SV30010 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200072 | |
| 96 well tissue culture plates | Fisher | 07-200-89 | |
| 96 well round bottom sterile plates (not coated) | Fisher | 07-200-745 | |
| Mouse IL-6 Duoset ELISA kit | R&D Biosystems | DY406 | |
| Mouse TNFa Duoset ELISA kit | R&D Biosystems | DY410 | |
| Fluorescein diacetate | Sigma-Aldrich | F7378 | |
| RLT Bufer | Qiagen | 79216 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74134 | |
| Vybrant Phagocytosis Assay Kit | Invitrogen | V-6694 |
References
- Kaufmann, S. H. E., Medzhitov, R., Gordon, S. . The innate immune response to infection. , (2004).
- Adams, D. O., Hamilton, T. A. The cell biology of macrophage activation. Annual review of immunology. 2, 283-318 (1984).
- Fujiwara, N., Kobayashi, K. Macrophages in inflammation. Current drug targets. Inflammation and allergy. 4, 281-286 (2005).
- Gordon, S., Martinez, F. O. Alternative activation of macrophages: mechanism and functions. Immunity. 32, 593-604 (2010).
- Martinez, F. O., Helming, L., Gordon, S. Alternative activation of macrophages: an immunologic functional perspective. Annual review of immunology. 27, 451-483 (2009).
- Fairweather, D., Cihakova, D. Alternatively activated macrophages in infection and autoimmunity. Journal of autoimmunity. 33, 222-230 (2009).
- Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. Macrophage polarization in bacterial infections. Journal of immunology. 181, 3733-3739 (2008).
- Mantovani, A., Sica, A., Locati, M. Macrophage polarization comes of age. Immunity. 23, 344-346 (2005).
- Burke, B., Lewis, C. E. . The macrophage. , (2002).
- Lee, G., Santat, L. A., Chang, M. S., Choi, S. RNAi methodologies for the functional study of signaling molecules. PloS one. 4, (2009).
- Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. Journal of biomolecular screening. 14, 151-160 (2009).
- Alper, S., et al. Identification of innate immunity genes and pathways using a comparative genomics approach. ProcNatl Acad Sci USA. 105, 7016-7021 (2008).
- De Arras, L., et al. An evolutionarily conserved innate immunity protein interaction network. J. Bio. Chem. , 1967-1978 (2013).
- Yang, I. V., et al. Novel regulators of the systemic response to lipopolysaccharide. Am J Respir Cell Mol Biol. 45, 393-402 (2011).
- Yang, I. V., et al. Identification of novel innate immune genes by transcriptional profiling of macrophages stimulated with TLR ligands. Molecular immunology. 48, 1886-1895 (2011).
- Yang, I. V., et al. Identification of novel genes that mediate innate immunity using inbred mice. 유전학. 183, 1535-1544 (2009).
- Raschke, W. C., Baird, S., Ralph, P., Nakoinz, I. Functional macrophage cell lines transformed by Abelson leukemia virus. Cell. 15, 261-267 (1978).
- Ralph, P., Moore, M. A., Nilsson, K. Lysozyme synthesis by established human and murine histiocytic lymphoma cell lines. The Journal of experimental medicine. , 1528-1533 (1976).
- Zumbansen, M., et al. First siRNA library screening in hard-to-transfect HUVEC cells. Journal of RNAi and gene silencing. 6, 354-360 (2010).
- Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42, 145-151 (2008).
- Aliprantis, A. O., et al. Cell activation and apoptosis by bacterial lipoproteins through toll-like receptor-2. Science. 285, 736-739 (1999).
- Alexopoulou, L., Holt, A. C., Medzhitov, R., Flavell, R. A. Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3. Nature. 413, 732 (2001).
- Conforti, R., et al. Opposing effects of toll-like receptor (TLR3) signaling in tumors can be therapeutically uncoupled to optimize the anticancer efficacy of TLR3 ligands. Cancer Res. 70, 490-500 (2010).
- Fernandez-Botran, R., Větvička, V. . Methods in Cellular Immunology. 8, 8 (2001).
