시상 하부 세포 모델에서 세포 사멸을 결정하는 카스파 다중 분석의 사용
Summary
멀티 플렉스 분석은 기본 세포 메커니즘에 대한 유익한 정보를 제공하고 시약 및 불필요한 반복 실험의 낭비를 제거 할 수 있습니다. 우리는 팔 미트 산으로 산화 반칙으로 체외 시상 하부 모델에서 세포 생존을 결정하기 위해, 형광 및 발광 기반의 방법을 사용하여, 여기에 멀티 플렉스 카스파 3 / 7 활동 분석에 대해 설명합니다.
Abstract
복잡한 세포 메커니즘의 연구에서 분석을 다중화하는 능력은, 반복적 인 실험의 필요성을 없애 내부 제어를 제공하고, 비용 및 시약에 폐기물을 감소시킨다. 여기에서 우리는 96 – 웰에서 생존 세포 수와 카스파 제 3 / 7 활성을 측정하기 위해 기반 분석법을 형광체 및 발광을 모두 사용하여, 시험 관내 시상 모델의 팔 미트 산 (PA)의 반칙 아폽토시스를 평가하기 위해 멀티 플렉스 분석의 최적화를 설명 마이크로 플레이트 형식입니다. PA의 반칙으로, 가능한 세포는 레사 주린 기반의 형광 분석에 의해 결정되었다. 카스파 제 3 / 7 활성은 luminogenic 기판 DEVD 및 세포 수로 정규화를 사용하여 측정 한 다음이었다. 이 다중 분석법은 포화 지방산 도전으로 사멸 자극, 다음 카스파 제 활성의 변화를 결정하기위한 유용한 기술이다. 포화 지방산 PA는 잠재적 importa을 나타내는 시상 산화 스트레스 및 세포 사멸을 증가시킬 수있다예컨대 그와 같은 분석법의 NCE은 포화 지방산과의 연결 기능 사이의 관계를 연구하는 기재.
Introduction
팔 미트 산 (PA) 등의 포화 지방산이 풍부한 다이어트는 비만과 심장 혈관 질환과 당뇨병 1, 2 등 다른 동반 질환에 연결되어있다. 고지방 사료 또한 산화 스트레스, 아폽토시스 및 시상 하부 신경 변성, 식욕 및 에너지 비용 3-7의 중요한 레귤레이터를 증가하는 것으로 나타났다. 높은 지방 다이어트 노출 시상 하부 조절 장애를 유발 통해 메커니즘을 이해하는 것은 비만에 대한 약물 치료의 발전을 위해 이렇게 중요합니다. 그러나,식이 지방이 신경 세포의 기능에 영향을 미치는 통해 세포 메커니즘은 불분명하다. 이러한 PA 등의 지방이 시상 하부의 세포 사멸 경로의 발병을 유발하는 방법의 더 나은 이해는이 목표를 향해 필요한 첫 번째 단계입니다. 이 문서의 목적은 시간의 연구에 사용하기 위해 개발 PA 노출에 신경 반응의 시험관 테스트를위한 다중 분석을 설명하는 것입니다ypothalamic 신경 퇴행. 우리는 PA 8 산화 공격 후 (A12)의 이용 차별화 된 불후의 성인 마우스 시상 하부 세포주에서 세포의 총 수 당 3 / 7 활동 카스파를 측정하기위한 시험 관내 96 – 웰 형식의 멀티 플렉스 분석에 대한 자세한 설명을 제공한다.
간단히, 세포 생존 능력은 레사 주린 기반 분석을 통해 PA의 반칙으로 결정된다. 레사 주린은 대사 활성 세포에있는 효소의 감소를 겪는 세포 투과성 화합물, 생각 프로세스는 미토콘드리아 (9)를 통해 발생합니다. 생존 세포는 지속적으로 생존 세포의 수에 비례하여 형광 신호를 생성하는, 레조 루핀 (resorufin) 레사 주린하는 변환. 카스파 제 3 / 7 활성은 다음 DEVD lumogenic 기반 분석을 사용하여 분석된다. DEVD는 카스파 제 -3에 의해 절단 아미노산 서열 (ASP-글루 – 발-ASP)이다. 이 서열은 세포 내 카스파 3 / 7의 활성화 및 후속 절단시 lumogenic 물질에 결합되면DEVD 기판으로, 발광 제품이 해제됩니다. 이 반응은 카스파 제 활성에 따라서 세포 자멸사의 유도에 비례한다. 사균은 카스파 제를 생산할 수 없기 때문에, 카스파 제 3 / 7 활성은 천연 과도로이고; 따라서 분석은 세포 스트레스의 효과에 따라, 4 시간 후 – 도전 30 분 사이에 완료되어야한다. 세포 생존율은 카스파 제 3 / 7 활성에 반비례하고 세포 사멸의 메카니즘을 결정하는데 사용될 수있다. 예를 들어,이 방법은 이전에 오렉신이 처리에 의해 영향을받는 메커니즘이 산화 손상 (10)에 대한 보호에 중요하다는 것을 시사 과산화수소 도전 시상 세포에서 세포 사멸을 감소 펩타이드 호르몬이 전처리를 표시하는 데 사용되었다. 그것은 그들이 분석 시약을 줄이기 위해 미토콘드리아 활성에 의존하는 이러한 어 세이는 세포주 및 조직 의존하는 것이 중요하다. 이 프로토콜은 성인 마우스의 시상 하부 (A12) 셀에 최적화되어 있습니다; 그러나,기재된 방법은 유사한 연구의 범위에 맞도록 변경 될 수있다.
단일 문화권에서 다중화 분석법 확실히 여러 가지 이유로 개별 분석을 수행하는 기존의 방법보다 이점을 제공한다. 시간, 세포 샘플 및 배양 시약을 저장하는 것 외에도, 다중화 분석법은 또한, 세포의 생존 및 사망의 지식을 제공 내부 제어를 제공하고, 반복적 인 실험 11, 12에 대한 필요성을 제거 할 수있다.
다른 방법은 96 – 웰 형식을 사용하여 특히, 신뢰할 수있는 분석이다 서양 말이나 ELISA를,에 의존하지만, 비용과 시간이 많이 소요 (1-2 일간)입니다있다. 이 다중화 분석을위한 세포 배양에 소요되는 시간을 제외하고, 전체 시간은 3 시간 미만이다. 이 프로토콜은 A12 세포와 함께 사용하기 위해 최적화되어 있지만 셀의 무결성에 영향을 미칠 수있는 요인 염두에 유지하면서, 다른 모델에서 사용하기 위해 변경 될 수있다. 제지이 프로토콜은 일련의 실험을 위해 일하면 마이닝은 샘플이나 실험 조건의 수에 계획된 다운 스트림 실험에 따라 달라집니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
멀티 플렉스 분석은 PCR 마이크로 어레이, 면역 및 기타 단백질 기반 검출 방법 13, 14 등 다양한 응용 프로그램에서 과학자들에 의해 사용 된 잘 받아 기술이다. 최근, 다중 분석이 점점 체외 플레이트 기반의 실험에 이용하고 세포 독성을 평가하는 정확한 방법으로 검증하고 12 생존 한되었다. 위의 프로토콜에서는, 우리는 PA의 반칙으로 A12 세포에서 카스파 제 3 / 7 활동과 세…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
여기에 설명 된 작업은 재향 군인의 업무의 미국학과 생물 의학 연구소 연구 개발 BX001686-1A1와 VA 재활 연구 및 개발에 의해 투자되었다.
Materials
| Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| Fetal bovine serum | PAA Labs | A15-751 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| Dimethy sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
PrestoBlue Cell Viability Reagent |
Invitrogen | A13262 | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay Systems | Promega | G8091 | |
| Equipment | |||
| 96W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | Molecular Devices |
References
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