유방암 세포에서 에스트로겐 조절 마이크로 RNA의 프로파일

1. 세포 배양 배지의 제조 T47D 세포주 배양 배지 용 : 멸균 1 L 병 500 ㎖ F12 [DMEM/F12 (1:1)]와 함께 500 ㎖의 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM)을 섞는다. 소 태아 혈청 50 ㎖ (이 5 % FBS를 만든다), 후 페니실린 스트렙토 마이신 10 ㎖ (이것은 1 %의 해충을 만든다)를 추가합니다. 완전히 내용을 섞는다. 4 ℃에서 보관 MCF7 세포주 배양 배지 용 : 25 FBS (5 % FBS)의 ML 후 5 페니실린 스트렙토 마이신 (1 % PEST)의 ㎖를 500 ㎖의 DMEM 섞는다. 4 ℃에서 보관 감소 된 혈청 배지의 경우 : T47D의 경우 : 멸균 1 L 병 500 ㎖ F12 (1:1)과 500 ㎖의 페놀 레드가없는 DMEM을 혼합, 5 % DCC-FBS에 대한 덱스 트란 코팅 된 숯 처리 (DCC) FBS 50 ㎖를 추가합니다. 0.5 % DCC-FBS에 대한 5 ㎖ DCC-FBS와 별도의 병을 확인합니다. 그런 다음, 각각의 병에 해충 (1 % PEST) 10 ㎖를 추가합니다. 완전히 내용을 혼합, STOR4 ° C에서 전자 MCF7의 경우 : 100 배의 L-글루타민 5 ㎖ (200 mM의 최종 농도)과 500 ㎖의 페놀 레드가없는 DMEM을 섞는다. DCC-FBS (5 % DCC-FBS)의 25 ML을 추가합니다. 2.5 ㎖의 DCC-FBS (0.5 % DCC-FBS)과 별도의 병을 확인합니다. 그런 다음, 각각의 병에 해충 (1 % PEST) 5 ㎖를 추가합니다. 4 ℃에서 완전히 매장을 내용을 혼합 인산 완충 식염수 (PBS) 용액 용 : 초순수 나 증류수로 1 L 멸균 유리 병을 채우십시오. 한 PBS 태블릿을 추가하고 태블릿이 용해 될 때까지 때때로 흔들어. 실온에서 PBS 용액 및 판매자를 압력솥. 리간드 주식의 준비 : 멸균 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 100 ㎕의 에탄올 또는 DMSO에 17β-에스트라 디올 2.72 ㎎의 용해에 의해 E2의 100 ㎜ 주식 솔루션을 준비하고 부드럽게 내용을 혼합한다. 간단히 스핀 10 ㎜, 1 ㎜, 0.1 ㎜ 재고 concentr를 산출하는 일련 희석 (1:10)합니다용매를 사용하여 관리 포인트. -20 ° C에서 모든 E2 주식 솔루션을 저장 멸균 1.5 ML microcentrifuge 관에 100 μL의 EtOH 또는 DMSO에 ICI 182,780의 6.07 MG를 용해하여 ICI의 100 ㎜ 주식 솔루션을 준비하고 부드럽게 내용을 혼합한다. 간단히 스핀 10 ㎜, 1 ㎜, 용매를 사용하여 0.1 ㎜의 주식 농도를 산출하는 일련 희석 (1:10)합니다. -20 ° C에서 모든 ICI 주식 솔루션을 저장 비히클은 용매 (에탄올 또는 DMSO)이다. -20 ° C에서 멸균 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브 및 저장소에 100 % 에탄올 또는 DMSO의 0.5 ML를 배치 2. 세포 배양 및 치료 기술은 복제 이중 또는 삼중 판에 각각의 처리를 수행합니다. 이 세포주의 생물학적 역할을 복제하는 것과 같은 세포주의 다른 통로를 이용한 세포 배양 및 치료 과정을 반복한다. REPL에 다른 셀 라인과 절차를 반복하나 이상의 세포주에서의 연구 결과를 icate. 모든 세포 배양 기술은 층류 후드에서 무균 조건 하에서 수행되어야한다. 세포 배양 시작 멸균 따뜻한 물을 욕조에 37 ° C에 미디어를 따뜻하게. T47D 또는 MCF7 세포의 고정 된 유리 병을 해동. 70 % 에탄올로 유리 병 및 미디어 병의 외부를 청소 한 다음 멸균 층류 후드에 유리 병 병을 모두 놓습니다. (후드) 따라 멸균 T-75 플라스크 레이블을 지정합니다. (즉, 표면이 완전히 매체로 덮여 확인) 멸균 혈청 피펫을 사용하여 플라스크에 해당하는 용지의 12 ~ 15 ML을 추가합니다. 플라스크에 유리 병에서 세포를 전송하고 부드럽게 섞는다. 5 % CO 2와 함께 제공되는 37 ° C 배양기에서 플라스크를 놓습니다. 치료를위한 세포의 준비 인큐베이터 밖으로 세포를 가지고 세포가 80 % 이상을 공동으로 보장하기 위해 현미경으로 관찰nfluent. 이 실험에 대한 충분한 세포가 있다는 것을 확인하는 것입니다. 멸균 후드에 플라스크를 전송합니다. 진공에 연결 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 플라스크에서 용지를 제거합니다. 부드럽게 PBS로 두 번 붙어 세포를 씻어. 플라스크에 따뜻한 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1 ㎖를 추가하고 2 분 동안 인큐베이터에서 플라스크를 넣어. 이것은 세포가 플라스크에서 분리하는 것이다. 플라스크에 3 ~ 4 ㎖의 적절한 따뜻한 미디어를 추가하고 5 ㎖ 혈청 피펫을 사용하여 분리 된 세포를 씹다. 혈청학 피펫으로 셀을 차지 압력을 증가 플라스크의 바닥에 대해 배치 된 피펫 팁으로 세포를 방출 의해 분쇄 액. 이것은 하나의 세포로 떨어져 세포를 파괴하는 것입니다. 제조자의 프로토콜에 따라, 세포 계수기를 사용하여 세포, 예를 센다. (필요에 따라) 100 밀리 판을 레이블과 접시에 약 10 ㎖의 미디어를 추가 할 수 있습니다. 플레이트 약 2.0 X 10 6 세포 / 플레이트. GE에 의해 세포를 배포ntle 판을 소용돌이. 약 80 %의 합류 때까지 48 시간 동안 세포를 품어. 80 %의 포화 상태에서, PBS로 두 번 세포를 세척하고 해당 5 % DCC-FBS 미디어를 추가 할 수 있습니다. 그 후, 24 시간 동안 세포를 배양한다. 24 시간 후, PBS로 두 번 세포를 세척하고 해당 0.5 % DCC-FBS 미디어를 추가 할 수 있습니다. 그런 다음, 추가로 48 시간 동안 세포를 배양한다. 세포 치료 48 시간 후, PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. 가능한 한 PBS의 많은 부분을 제거해야합니다. 15 ML 원뿔 관에서 적절한 0.5 % DCC-FBS 매체의 10 ML을 추가합니다. 그런 다음, 10 nm의 최종 농도 0.1 mM의 리간드 재고 (E2 또는 ICI)의 1 μl를 추가합니다. 또한, 제어 실험에 대한 별도의 튜브에 10 ㎖ 미디어에 차량의 1 μl를 추가합니다. 부드럽게 튜브의 내용을 섞어서 접시에 셀을 추가 할 수 있습니다. 이 접시 당 하나의 리간드해야한다. 선택한 시점 (0-72 시간)에 세포를 품어. <P 클래스 = "jove_title"> 3. RNA 추출 및 품질 관리 RNA 추출 처리 시간은 원하는 시간 동안 끝나면 접시에 세포를 약 1-2 ㎖의 구 아니 디늄 티오 시아 네이트 – 페놀 용액을 부가 한 다음, PBS로 두 번 세포를 씻어. 주의 : 아니 디늄 티오 시아 네이트 – 페놀 용액을 흡입, 피부 나 눈에 접촉에 의한 독성하거나 삼키면. 적절한 보호 복, 보호 장갑 및 눈 / 안면 보호구를 착용하고, 흄 후드를 사용합니다. 세포의 부피가 구 아니 디늄 티오 시아 네이트 – 페놀 용액의 부피의 더 이상 10 % 이하이고, 판을 용액 피복 1 분 동안 앉아 있도록되어 있는지 확인. 그런 다음, 고무 스크레이퍼를 사용하여 세포를 긁어 microcentrifuge 관에 전송합니다. 세포 주 동안 -80 ° C에서이 솔루션에 저장할 수 있습니다. 추출 및 스핀 칼럼 정제 및 DNase의 뒤에 구 아니 디늄 티오 시아 네이트 – 페놀 – 클로로포름 법을 이용하여 각 처리로부터 전체 RNA를 정제동물 세포에 대한 I DNA 분해 방법. 추출 후, 세포를 60 μL의 RNase가없는 물에 용출된다. C. ° -80에서 정량 분석​​ 및 저장 RNA에 대한 나누어지는 1 ~ 2 μL의 RNA RNA와 aspectrophotometer 1 μL를 사용하여 RNA 농도를 측정한다. 모든 측정이 완료되기 전에 찍은 공백이 있는지 확인하십시오. 또한, 완전히 측정을 촬영 분광 광도계의 도달 시간을 닦습니다. 농도는 일반적으로 NG / μL에 표시됩니다. RNA 농도를 보여주는 결과를 저장합니다. RNA의 품질 관리 microcentrifuge 관에있는 각각의 샘플과 장소에 대한 100 NG의 RNA를 가져 가라. bioanalyzer를 사용하여 RNA의 무결성을 측정한다. 보통 12 샘플 bioanalyzer에서 한 번에 실행할 수 있습니다. 실행은 일반적으로 약 25 분 소요됩니다. RNA는 실험을 위해 좋은 있는지 확인하기 위해 RNA의 사다리 결과를 비교. 저장 및 인쇄 결과. 4. 치료의 확인, 표준 : 단백질 코딩 유전자의 qPCR에 cDNA 합성 (각 샘플의) 총 RNA 500 NG 또는 1 μg을 가지고 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 넣어. 최대 RNase가없는 물을 사용하여 10 μL 각 튜브의 볼륨을 가져와. 10 분 동안 70 ° C에 50 μM 임의의 헥사 프라이머 및 열 튜브의 2 μl를 추가합니다. 5 분 동안 얼음에 튜브를 전송합니다. 각 샘플의 경우, 배 첫 번째 가닥 버퍼 4 μL, 0.1 M DTT의 1 μL, 10 mM의 dNTPs를 1 μL, 첨자 III의 0.5 μL, 1.5 μL의 RNase가없는 물을 추가합니다. 10 분 동안 25 ° C의 열 블록 또는 물을 욕조에 넣고 관. 1 시간 동안 46 ° C의 열 블록에 전송 관. 이어서, 15 분간 70 ° C의 열 블록 전열관은 반응을 정지. -20 ℃ 희석과 상점에 대한 RNase가없는 물을 사용 (총 RNA의 입력을 사용하여 계산) 5 NG / μL 주식에 cDNA를 희석 qPCR에 관심과 참고 유전자의 유전자에 대한 프라이머를 얻습니다. 프라이머 간단 NCBI의 뇌관-BLAST 프로그램 (12)에 대한 프라이머 설계 도구를 이용하여 설계 될 수있다. 이것은 일반적으로 관심의 각 유전자의 전방 및 역 프라이머를 생성합니다. 프라이머의 길이는 18-22 염기쌍이어야, 52-58 °의 C의 융점이 40 % ~ 60 %의 GC 함량을 가지고, 100-180 염기쌍의 앰플 리콘 길이. 각각의 qPCR 반응 아니라, cDNA의 NG (단계 4.1.7에서 재고 농도에서 2 μL), 앞으로 각 1 pmol의 10을 추가하고 (단계 4.2.1에서) 그 유전자의 프라이머를 반전, 5 μL의 배 시아닌 염료 PCR 마스터 믹스. 각 웰에 대한 반응은 10 μl의 최종 반응 볼륨이 있어야합니다. (기술은 복제의 경우) 각 유전자에 대한 각 샘플에 대한 세중의 우물이 있다는 것을 확인합니다. 96 – 웰 반응 플레이트가 사용될 수있다. QRT-PCR 시스템 소프트웨어에서, 기자와 대상을 할당 반응 부피를 입력, 비교를 선택임계 사이클 (ΔΔCT) 방법 및 샘플 우물을 정의합니다. 하나의 특정 단편의 증폭을 확인하기 위해 시아닌 염료 실행을위한 융해 곡선 분석을 수행해야합니다. 실행에 대한 기본 설정을 사용하여 번호판을 실행합니다. 실행 후 결과 및 데이터 내보내기 (MS Excel로, 특히 CT 값)을 저장합니다. ΔΔCT의 공식을 사용하여 qPCR의 데이터 분석 상대적인 mRNA 발현의 변화는 다음 단계를 사용하여 각 시료에 대한 엑셀 제어 방면 변경 상대적으로 계산 될 수있다 : 위의 qPCR에서 보낸 모든 결과는 캐럿의 값이 포함되어 있어야합니다. 아래 공식을 사용하여 식에서 ΔCT 값을 계산한다 : 식에서 ΔCT = CT (표적 유전자) – CT (참조 유전자) 이것은 각각의 샘플에 대해 수행해야합니다. 대상은 관심의 유전자 또는 miRNA의입니다. 다음으로, 각 샘플의 총 표준 편차 (SD)를 계산합니다. 첫 번째 계산참조 유전자 후 표적 유전자 (이것은 CT 값에서 STD DEV 함수를 사용하여 엑셀에서 수행 될 수있다)을위한 SD를 산출 SD. 그런 다음이 수식을 사용하여 각 샘플에 대한 총 SD를 계산 : 전체 SD = (SD2 (대상) + SD2 (참고)) 1 / 2 에 의해 유전자 (대상) 내에서 각 샘플의 ΔΔCT를 계산 ΔΔCT = ΔΔCT (치료 / 시험 샘플) – ΔΔCT (제어 / 교정기 샘플) 캘리브레이터 샘플은 처리되지 않은 샘플입니다. 마지막으로, 수식을 사용하여 각 샘플의 배 변화 (FC) 값을 계산합니다 : FC = 2 ΔΔCT 각 샘플의 접이식 변경 값은 상기 기준 유전자 및 대조 샘플로 정규화 한 유전자 / miRNA의 상대적 표현을 제공한다. 스튜던트 t-시험은 양측 분포 및 2 샘플 불균등 분산을 사용하여 통계 분석을 위해 사용될 수있다파라미터 (P <0.001 (***), P <0.01 (**), 및 P <0.05 (*)). 이 엑셀에 달성 될 수있다. 치료가 miRNA의 프로파일을 진행하기 전에 알려진 대상 규제의 결과 있는지 확인합니다. 5. miRNA의 프로파일 분석 miRNA의 마이크로 어레이 microcentrifuge 관에 차량 또는 리간드, 장소 하나와 함께 처리 된 세포에서 고립 된 RNA 5 μg을 가져 가라. 20 μL에 관에서 볼륨을 조정합니다. 각각의 비교 중복 또는 삼중으로 수행해야합니다. 위의 RNA 샘플을 사용하여 miRNA의 마이크로 어레이를 수행합니다. miRNA의 마이크로 어레이 발현 프로파일은 μParaflo 미세 유체 바이오칩 기술에 의해 인간의 miRNA 마이크로 어레이 이중 색상 견본 배열 (생어 miRBase 릴리스 14.0) (13)을 사용하여 결정되어야한다. 결과는 차별적 표현의 miRNA를 표시해야합니다. P <0.05.p-값 <0.10도 더 협력을 위해 고려 될 수있을 때 중요한 miRNA의 식을 고려qPCR에를 사용 nfirmatory 분석. qPCR에있는 더 검증이 miRNA의 목록을 저장합니다. miRNA의 프로파일 : DLP-LDA 각 샘플은 중복 또는 삼중으로 분석해야한다. 차량이나 리간드 하나와 함께 처리 된 세포에서 총 RNA 700 NG를 가지고, microcentrifuge 관에 배치합니다. 3 μL에 관에서 볼륨을 조정합니다. 이중 레이블 프로브 miRNA의 정량법 및 10X RT 프라이머를 사용하여 cDNA 합성을 수행한다. 각 반응의 총 부피는 7.5 ㎕를해야한다. PCR 시스템의 열 순환기에 반응 관을 배치하고 이중 레이블 프로브의 miRNA 분석 방법에 표시된 권장 매개 변수를 설정합니다. 실행을 시작합니다. 이 cDNA를 생성합니다. cDNA를 적어도 1 주일 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. RT 반응이 실행되는 동안, DLP-LDA 판을 꺼내 실온에 앉아 할 수 있습니다. 각 배열 판은 고유의 miRNA 프라이머 및 제어 프라이머를 포함 384 우물을 포함하고 있습니다. 1.5 ML의 microcentrifuge 관에서 6 (5.2.3에서)의 cDNA ㎕의 장소를 가지고 간다. 이중 레이블 프로브 2 배 범용 PCR 마스터 믹스 450 μl를 추가하고 444 μL의 RNase가없는 물을 추가합니다. 내용과 원심 분리기를 짧게 혼합 관에게 여섯 번 반전. DLP-LDA 판은 여덟 각각에 실내 온도, 부하 100 μL에 도달하면 판의 '포트를 입력합니다'. 그런 다음, 배열 판을 원심 분리기. QRT-PCR 시스템을 열고 블록이 있는지 확인하는 384 – 웰 플레이트. SDS 소프트웨어를 사용하여 런타임을 설정합니다. 상대 정량 (CT)을 선택, 잘 번호와 배열 유형을 선택하고 우물을 정의하는 샘플에 대한 설명을 입력합니다. 기본 열 사이클링 조건을 사용하여 배열을 실행합니다. 실행이 완료되면, MS Excel로 결과 및 수출을 저장하고 ΔΔCT 식 (4.3 단계)를 사용하여 추가 분석을 위해 저장합니다. 6. 분리를 사용하여 miRNA의 규정 확인qPCR의 분석 시아닌 염료의 qPCR 분석 원하는 miRNA의 분석을위한 디자인 프라이머. 포워드 프라이머와 같은지 성숙의 miRNA의 시퀀스는 14 mirbase.org로부터 얻을 수있다. 'T'모든 'U'로 변환합니다. cDNA를 준비 : 1.5 ㎖의 원심 분리 관에서 총 RNA 및 장소 1 μg을 가져 가라. 폴리 A는 miRNA의 첫 번째 가닥의 cDNA 합성 및 QRT-PCR 프로토콜에서 미행과의 miRNA의 첫 번째 가닥 cDNA 합성에 대한 지침을 따르십시오. -20 ° C에서 생성 된 cDNA (1시 10분) 및 저장을 희석 한 96 웰 반응 플레이트를 얻습니다. 각각의 miRNA의 qPCR 반응에 잘 단계 6.1.2에서 키트 (16 폴리 A의 cDNA NG (단계 6.1.2에서), (단계 6.1.1에서) 특정 앞으로 프라이머의 각각의 2 pmol의 및 보편적 인 프라이머를 추가 ) 및 2 배의 qPCR 마스터 믹스의 5 μL. 최종 반응 부피가 10 μL / 잘. (기술은 복제에 대한) 각각의 miRNA에 대한 각 샘플에 대한 세중의 우물이 있다는 것을 확인합니다. 또한, 참조 유전자 (보통 U6 snRNA)가 포함되어 있는지 확인하십시오. QRT-PCR 시스템 소프트웨어에서, 기자와 대상을 할당 반응 부피를 입력, 비교 임계 사이클 (ΔΔCT) 방법을 선택하고 샘플 우물을 정의합니다. 실행에 대한 기본 설정을 사용하여 번호판을 실행합니다. 모든 시아닌 염료 실행을위한 녹는 곡선 분석을 수행해야합니다. 각각의 용융 곡선은 하나의 특정 단편의 증폭을 확인하는 하나의 특정 피크를 표시해야합니다. 하나 이상의 피크 또는 명확한 피크가 관찰되는 경우, 프라이머는 특정되지 않고 데이터는 사용할 수 없다. 실행 후 결과 및 데이터 내보내기 (MS Excel로, 특히 CT 값)을 저장합니다. 이중 레이블이 프로브의 qPCR 분석 0.2 ML microcentrifuge 관에 5 μL 볼륨과 장소에 각 총 RNA 10 ng의 각을 가져 가라. 이중 레이블 프로브 마이크로를 사용하여 역전사 (RT)을 수행의 프로토콜과 지침에 따라RNA 역전사 키트 15. 각 총 반응 부피는 15 ㎕를해야한다. 이중 레이블 프로브 RT 반응에 대해 연구 할 각 miRNA의 특정 프라이머가 있습니다. 장소 반응 PCR 시스템의 열 순환기의 튜브 및 프로토콜에 따라 매개 변수를 설정은 위의 단계 6.2.2에 표시된. 실행을 시작합니다. 그것은 약 70 ~ 80 분 소요됩니다. RT 반응 후, 1:5 비율로 샘플의 cDNA를 희석하고, -20 ° C에서 어둠 속에서 모두의 cDNA를 저장 한 96 웰 반응 플레이트를 얻습니다. 이중 레이블이 프로브의 10 ㎕의 2 배 범용 PCR 마스터 믹스 (단계 5.2.5과 같은 시약), RNase가없는 물 7.67 μL, 20 × 실시간 분석 프라이머 1 ㎕를 각 miRNA의 qPCR에 반응을 잘 다음을 추가합니다 (각 miRNA의 특정), 그리고 위의 단계 6.2.4에서의 cDNA 1.33 μL. 이것은 20 ㎕의 최종 반응 부피해야합니다. 부드럽게 내용을 혼합하고, 원심 분리기 잠시. 그 일을 확인감수 (기술은 복제에 대한) 각각의 miRNA에 대한 각 샘플에 대한 세중의 우물이다. 또한, 참조 유전자 (보통 U6 snRNA)가 포함되어 있는지 확인하십시오. QRT-PCR 시스템 소프트웨어에서, 그 각각의 miRNA (대상)의 기자 (FAM)와 소광 (NFQ-MGB)을 할당 반응 부피를 입력, 비교 임계 사이클 (ΔΔCT) 방법을 선택하고 샘플 우물을 정의합니다. 이중 레이블 프로브 마이크로 RNA 분석 프로토콜에서 실행 qPCR에 대한 매개 변수를 설정하기위한 지시 사항을 따르십시오. 그런 다음, 실행을 시작합니다. 실행 후 결과 및 데이터 내보내기 (MS Excel로, 특히 CT 값)을 저장합니다.