הוכחת סמים רבים עמידים<em> חפת Mycobacterium</em> Microarray ההגברה
Summary
Microarray הגברה משלב הכלאת הגברה וmicroarray PCR אסימטרי לתוך תא בודד, אשר מייעל באופן משמעותי את זרימת עבודה microarray למשתמש הקצה. פישוט זרימת העבודה microarray הוא צעד ראשון הכרחי ליצירת אבחון מבוסס microarray שניתן להשתמש באופן שיגרתי בסביבות נמוכים יותר משאבים.
Abstract
פישוט זרימת העבודה microarray הוא צעד ראשון הכרחי ליצירת אבחון מבוסס microarray MDR-TB שיכול לשמש באופן שיגרתי בסביבות נמוכים יותר משאבים. Microarray הגברה משלב הגברה סימטרית PCR, בחירת גודל היעד, תיוג היעד, וכלת microarray בתוך פתרון אחד ולתוך תא microfluidic אחת. שיטת עיבוד אצווה באה לידי ביטוי עם שילוב 9-Plex סימטרי אב וmicroarray אלמנט ג'ל בצפיפות נמוכה לgenotyping חפת סמים רב Mycobacterium עמיד (MDR-TB). הפרוטוקול המתואר כאן ניתן להשלים ב6 שעות ולספק גנוטיפ נכון עם לפחות 1,000 שווה תא של הדנ"א הגנומי. שילוב על גבי שבב צעדים לשטוף אינו ריאלי, אשר יגרמו לשיטת amplicon סגורה לגמרי ומערכת. עם microarray הגברה ההיקף של ריבוב מוגבל סופו של דבר במספר זוגות פריימר שניתן לשלב מ 'אדון יחידix ועדיין להשיג רגישות רצויה ומדדי ביצועים ספציפיים, במקום מספר הבדיקות שהם משותקים במערך. כמו כן, בסך הכל בפעם הניתוח יכול להתקצר או התארכה בהתאם לשימוש הספציפי המיועד, שאלת מחקר, ומגבלות רצויות של זיהוי. עם זאת, הגישה הכללית מייעלת באופן משמעותי את זרימת עבודה microarray למשתמש הקצה על ידי צמצום מספר שלבי עיבוד ידני אינטנסיביים וזמן רב, ומספקת נתיב ביוכימי וmicrofluidic פשוט עבור תרגום אבחון מבוסס microarray לתוך פרקטיקה קלינית שגרתית.
Introduction
מקרה גילוי מוקדם וטיפול מהיר נחשבים שליטת האסטרטגיות היעילות ביותר להפחית חפת Mycobacterium הילוכים (MTB) 1, ועכשיו יש הסכמה רחבה בקהילת שחפת שנקודת הטיפול (POC) או בסמוך לבדיקת POC לאבחון שחפת בו זמנית ויש צורך בעמידות לתרופות (DR). טכנולוגיות כגון GeneXpert של קפאידים ובדיקות הגברה אחרות חומצות גרעין לצמצם את הזמן לאבחון לחולי שחפת רבות, ולספק קריאה מתוך מהירה מצביע על עמידות לריפאמפין או מוטציות שנבחרו מקנות עמידות לתרופות הראשונות או שנייה אחרות קו 2. למרות בדיקות הגברה בזמן אמת וחומצות גרעין בידוד תרמיות נועדו לזהות את מוטציות עמידות לתרופה שתוביל לMDR-TB, הספקטרום של מוטציות הם מזהים הוא לעתים קרובות מספיק כדי לעצב משטר תרופה אישי המתאים לפרופיל העמידות לתרופות של החולה, ואילוצים טכניים הקשורותכדי לדבר לחצות אופטי או את המורכבות של תהליכים כימיים הגברה ודיווח מאי 3-7 להגביל את מספר הלוקוסים או מוטציות שאותרו. לכן, טכנולוגיות זיהוי עם יכולת ריבוב גבוהה יותר נדרשות כדי לטפל בפערים ידועים באבחון POC MDR-TB.
Microarrays ומבחני הבדיקה השורה אישרו-WHO Hain יכולים לתת מענה "גן מרובה, מוטציות רבות" האתגר של אבחון MDR-TB 8-29. למרבה הצער,, פלטפורמות גילוי אלה המבוססים על הכלאת ריבוב משתמשות רב שלבי, מסובכים, ופרוטוקולים הפתוח amplicon הדורשים הכשרה משמעותית ומיומנות בטכניקות מולקולריות. Microarray ההגברה 30 נועד לטפל בכמה microarray זרימת העבודה אלה ודאגות תפעוליות. עקרונות fluidic פישוט הם כדי להגביר, להכליא, ולזהות מטרות חומצות גרעין בתוך תא microfluidic אחת. המשתמש מציג mas החומצה והגברת הגרעיןter לערבב לתוך תא fluidic עם טפטפת ומתחיל פרוטוקול הרכיבה התרמי. לשיטת העיבוד אצווה שמוצגת כאן, microarrays נשטפים לאחר מכן בפתרון בתפזורת, מיובש, וצלם. מחקר זה מדגים את הפונקציונליות של microarray הגברה באמצעות בדיקת MDR-TB microarray לrpoB (30 מוטציות), katG (2 מוטציות), Inha (4 מוטציות), rpsL (2 מוטציות), embB (מוטציה 1), IS1245, IS6110 , והגברה פנימית ושליטה הכלאה. זוג תואם לפחות אחד מבדיקות microarray (wildtype (WT) ומוטציה של נוקלאוטיד יחיד (MU)) כלול בכל אחד מוטציה של עניין. חומצות גרעין מזוקקים ממ 'עמיד סמים רב שחפת הן מזני שחפת TDR הבנק ביום 31. microarrays אלמנט ג'ל מיוצרים על מצעי זכוכית על ידי copolymerization בעצם כפי שתואר במקומות אחרים 32, פרט לכך שאנו משתמשים מונומר 4% ו0.05 מ"מ כל אחד בדיקה בpolymerizתערובת ation. מערכים מוקפים באטם 50 מיליליטר לפני השימוש. לאחר שלבי רכיבה התרמית, הכלאה, ולשטוף, microarrays ההגברה הם צילמו על מנתח נייד Akonni. , עוצמות אות משולבות מתוקן רקע מתקבלות הגלם. תמונות tif באמצעות אלגוריתם מעגל קבוע. רעש עבור כל רכיב ג'ל מחושב כשלוש פעמים סטיית התקן של רקעי נקודה המקומיים. מטרות גן נחשבות בדרך כלל לגילוי עבור יחס אות לרעש (SNR) ערכי ≥ 3. על מנת לקבוע את קיומו או היעדריו של מוטציה ספציפית בכל גן או קודון, יחס מבחין מחושב מערכי יחס האות לרעש כ( WT-MU) / (WT + MU). יחסי מבחין <0 מעידים על מוטציה סמים התנגדות במוקד, ואילו יחסים> 0 מעידים על רצף wild-type.
Protocol
Representative Results
Discussion
עם microarray הגברה היקף הריבוב מוכתב סופו של דבר על ידי היעילות של PCR אסימטרי זמנית, לא microarray. מניסיוננו, 10-12 זוגות פריימר ייחודיים ניתן multiplexed בקלות בפורמט microarray הגברה. קריטריוני פריימר ועיצוב חללית קונבנציונליים ולכן חלים על מבחני חדשים, חוץ מזה שצריך גם להביא בחשבון את ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) בAI089106 RC3 המענק.
חומצות גרעין MDR-TB סופקו על ידי תכנית הפיתוח של הקרן / האו"ם / בנק העולמי / ארגון הבריאות העולמית מיוחדת תכנית הילדים של האו"ם למחקר והדרכה במחלות טרופיות (TDR), ג'נבה, שוויץ.
אנו מודים לד"ר טום Shinnick של המרכז האמריקאי לבקרת מחלות ומניעתן להדרכה בגנים ומוטציות הספציפיים שתיכלל בassay אב הטיפוס.
Materials
| MDR-TB amplification microarrays, with applied gasket and pre-cut cover slips | Akonni Biosystems | Inquire | |
| Multiplex PCR kit, containing 2X PCR buffer with HotStar Taq plus | Qiagen | #206143 | |
| Taq polymerase | Qiagen | #201207 | |
| RNAse-free water | Qiagen | #206143 | |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP227-500 | |
| 20 mg mL-1 non-acetlyated bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | #3B6917 | |
| 5X concentrated MDR-TB primer mix | Akonni Biosystems | Inquire | |
| 500 fg uL-1 amplification and inhibition control | Akonni Biosystems | Inquire | |
| 20X SSPE | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP1328-4 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP151-500 | |
| Disinfecting Spray | Current Technologies, Inc. | #BRSPRAY128 | |
| 70% Isopropyl Alcohol | Decon Labs, Inc. | #8416 | |
| Equipment | Company | Catalog Number | |
| Microarray imager, with automated image and data analysis software | Akonni Biosystems | 100-20011 | |
| Thermal cycler with flat block insert | Akonni Biosystems | 100-10021 | |
| High-throughput wash station and slide holder | ArrayIt | HTW | |
| Dissecting forceps | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #10-300 | |
| Mini Vortexer | VWR | #3365040 | |
| Mini-centrifuge | VWR | #93000-196 | |
| Airbrush Compressor Kit | Central Pneumatic | #95630 |
References
- Lemaire, J. -. F., Casenghi, M. New diagnostics for tuberculosis: fulfilling patient needs first. J. Int. AIDS Soc. 13, 40 (2010).
- World Health Organization. . Tuberculosis diagnostic technology landscape. 42, (2012).
- Notomi, T., Okayama, H., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucl. Acids Res. 28, e63 (2000).
- Vincent, M., Xu, Y., Kong, H. Helicase-dependent isothermal DNA amplification. EMBO Rep. 5, 795-800 (2004).
- Pritchard, C. G., Stefano, J. E. Amplified detection of viral nucleic acid at subattomole levels using Q beta replicase. Ann. Biol. Clin. 48, 492-497 (1990).
- Compton, J. Nucleic acid sequence-based amplification. Nature. 350, 91-92 (1991).
- Guatelli, J. C., Whitfield, K. M., et al. Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1874-1878 (1990).
- Shi, X. C., Liu, X. Q., Xie, X. L., Xu, Y. C., Zhao, Z. X. Gene chip array for differentiation of mycobacterial species and detection of drug resistance. Chin. Med. J. , 3292-3297 (2012).
- Troesch, A., Nguyen, H., et al. Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays. J. Clin. Microbiol. 37, 49-55 (1999).
- Caoili, J. C., Mayorova, A., et al. Evaluation of the TB-biochip oligonucleotide microarray system for rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 44, 2378-2381 (2006).
- Waddell, S., Laing, K., Senner, C., Butcher, P. Microarray analysis of defined Mycobacterium tuberculosis populations using RNA amplification strategies. BMC Genomics. 9, 94 (2008).
- Fukushima, M., Kakinuma, K., et al. Detection and identification of mycobacterium species isolates by DNA microarray. J. Clin. Microbiol. 41, 2605-2615 (2003).
- Park, H., Jang, H., et al. Detection and genotyping of Mycobacterium species from clinical isolates and specimens by oligonucleotide array. J. Clin. Microbiol. 43, 1782-1788 (2005).
- Yao, C., Zhu, T., et al. Detection of rpoB, katG and inhA gene mutations in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Chongqing as determined by microarray. Clin. Microbiol. Infect. 16, 1639-1643 (2010).
- Sun, A. H., Fan, X. L., et al. Rapid detection of rpoB gene mutations in rif-resistant M. tuberculosis isolates by oligonucleotide microarray. Biomed. Environ. Sci. 22, 253-258 (2009).
- Volokhov, D. V., Chizhikov, V. E., Denkin, S., Zhang, Y. Molecular detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Methods Mol. Biol. 465, 395-417 (2009).
- Fu, L., Shinnick, T. M. Understanding the action of INH on a highly INH-resistant Mycobacterium tuberculosis strain using Genechips. Tuberculosis. 87, 63-70 (2007).
- Fu, L. M., Shinnick, T. M. Genome-wide exploration of the drug action of capreomycin on Mycobacterium tuberculosis using Affymetrix oligonucleotide GeneChips. J. Infect. 54, 277-284 (2007).
- Denkin, S., Volokhov, D., Chizhikov, V., Zhang, Y. Microarray-based pncA genotyping of pyrazinamide-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis. J. Med. Microbiol. 54, 1127-1131 (2005).
- Gryadunov, D. A., Mikhailovich, V., et al. Evaluation of hybridisation on oligonucleotide microarrays for analysis of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Clin. Microbiol. Infect. 11, 531-539 (2005).
- Tang, X., Morrix, S. L., Langone, J. J., Bockstahler, L. E. Microarray and allele specific PCR detection of point mutations in Mycobacterium tuberculosis genes associated with drug resistance. J. Microbiol. Methods. 63, 318-330 (2005).
- Wade, M. M., Volokhov, D., Peredelchuk, M., Chizhikov, V., Zhang, Y. Accurate mapping of mutations of pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 49, 89-97 (2004).
- Yue, J., Shi, W., et al. Detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by using a specialized oligonucleotide microarray. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 48, 47-54 (2004).
- Kim, S. Y., Park, Y. K., et al. Evaluation of the CombiChip Mycobacteria Drug-Resistance detection DNA chip for identifying mutations associated with resistance to isoniazid and rifampin in Mycobacterium tuberculosis. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 54, 203-210 (2006).
- Brown, T. J., Herrera-Leon, L., Anthony, R. M., Drobniewski, F. A. The use of macroarrays for the identification of MDR Mycobacterium tuberculosis. J. Microbiol. Methods. 65, 294-300 (2006).
- Brossier, F., Veziris, N., Truffot-Pernot, C., Jarlier, V., Sougakoff, W. Performance of the genotype MTBDR line probe assay for detection of resistance to rifampin and isoniazid in strains of Mycobacterium tuberculosis with low- and high-level resistance. J. Clin. Microbiol. 44, 3659-3664 (2006).
- Padilla, E., Gonzalez, V., et al. Comparative evaluation of the new version of the INNO-LiPA Mycobacteria and GenoType Mycobacterium assays for identification of Mycobacterium species from MB/BacT liquid cultures artificially inoculated with mycobacterial strains. J. Clin. Microbiol. 42, 3083-3088 (2004).
- Barnard, M., Gey van Pittius, N. C., et al. The diagnostic performance of the GenoType MTBDRplus Version 2 line probe assay is equivalent to that of the Xpert MTB/RIF assay. J. Clin. Microbiol. 50, 3712-3716 (2012).
- Sekiguchi, J. -. I., Nakamura, T., et al. Development and evaluation of a line probe assay for rapid identification of pncA mutations in pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains. J. Clin. Microbiol. 45, 2802-2807 (2007).
- Chandler, D. P., Bryant, L., et al. Integrated amplification microarrays for infectious disease diagnostics. Microarrays. 1, 107-124 (2012).
- Vincent, V., Rigouts, L., et al. The TDR Tuberculosis Strain Bank: a resource for basic science, tool development and diagnostic services. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 16, 24-31 (2012).
- Golova, J. B., Chernov, B. K., et al. Non-volatile copolymer compositions for fabricating gel element microarrays. Anal. Biochem. 421, 526-533 (2012).
- Cooney, C. G., Sipes, D., Thakore, N., Holmberg, R., Belgrader, P. A plastic, disposable microfluidic flow cell for coupled on-chip PCR and microarray detection of infectious agents. Biomed. Microdevices. 14, 45-53 (2012).
- Lane, S., Evermann, J., Loge, F., Call, D. R. Amplicon secondary structure prevents target hybridization to oligonucleotide microarrays. Biosens. Bioelectron. 20, 728-735 (2004).
- El-Hajj, H. H., Marras, S. A. E., et al. Use of sloppy molecular beacon probes for identification of Mycobacterial species. J. Clin. Microbiol. 47, 1190-1198 (2009).
- Boehme, C. C., Nabeta, P., et al. Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance. N. Engl. J. Med. 363, 1005-1015 (2010).
