Beyin Dilim Biyotinilasyonu: An<em> Ex Vivo</emYetişkin Nöronlar Bölge özgü Plazma Membran Protein Ticaretiyle Tedbir> Yaklaşım
Summary
Nöronal membran kaçakçılığı dinamik plazma membran proteini kullanılabilirliği ve önemli ölçüde etkiler sinir iletimini kontrol eder. Bugüne kadar, yetişkin nöronlar nöronal endositik ticaretini ölçmek için zor olmuştur. Burada, akut beyin dilimleri yüzey protein ifade ex vivo hızlı değişiklikleri ölçmek için son derece etkili, nicel bir yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
Düzenlenmiş endositik kaçakçılığı dinamik bir dakika zaman ölçeğinde reseptör, iyon kanalı, ve taşıyıcı hücre yüzey sunum kontrol ederek, nöromodülasyonundaki etkinlikleri kolaylaştırmak merkezi mekanizmadır. Tek tek proteinlerin endositik kaçakçılığı kontrol eden mekanizmalarla geniş bir çeşitlilik bulunmaktadır. Ticareti moleküler temellerini araştıran çalışmalar öncelikle niceliksel dışsal uyaranlara ve gen manipülasyonu yanıt membran protein yüzey ifadesindeki değişiklikleri ölçmek için yüzey biyotinlasyonu dayanmıştır. Bununla birlikte, bu yaklaşım esas olarak aynen yetişkin nöronların oynayan fizyolojik olarak ilgili mekanizmaları yansıtmayabilir kültürlenmiş hücreler, sınırlayıcı edilmiştir. Ayrıca, kültürlü hücre yaklaşımlar ticareti mekanizmaları bölgeye özgü farklılıkları hafife olabilir. Burada, biz akut beyin dilim hazırlanması için hücre yüzey biyotinilasyonunu uzanan bir yaklaşım açıklar. BizBu yöntem, yetişkin nöronların yüzey zar proteini seviyelerindeki hızlı değişiklikleri ölçmek için bir yüksek kalitede bir yaklaşım sağladığını gösterir. Bu yaklaşım nöronal endositik ticareti alanında geniş bir kullanım olması muhtemeldir.
Introduction
Endositik ticareti bütün zar proteinlerinin çeşitli plazma zarı tanıtımı ince ayar her yerde bulunan bir hücresel mekanizmadır. Endositozdan sonra hücre içi ortamı 1 için çok önemlidir besin sağlar ve reseptör aktivasyonu 2 tepki olarak reseptör sinyallemesini desensitizes. Geri plazma zarına dönüşüm endositik ek olarak hücre yüzeyinde de 3 protein ekspresyon seviyelerini arttırarak hücre sinyali artırabilir. Ayrıca, membran kaçakçılığı tedirginlikler protein endositik ticaretini yöneten moleküler mekanizmalarının araştırılması gerektiğini vurgulayarak, çok sayıda hastalık ve patolojik koşullarda 4,5 sorumlu tutulmaktadır. Çok protein, son birkaç yıl içinde kanıt montaj klasik klatrin bağımlı içselleştirme mekanizmaları kullanmak da çok klatrin bağımsız endositik mekanizmalar giderek artan bir dizi potansiyel endositik yöneten gösteriyorproteinler 6,7. Böylece, fizyolojik, ilgili sistemlerin ticareti kolaylaştırıcı endositik mekanizmaları araştırmak için ihtiyacı önemli ölçüde büyüdü.
Beyinde, reseptörler, iyon kanalları ve nörotransmitter nakliyecilerin endositik kaçakçılığı sinaptik plastisite 8-11 ve sonuçta nöronal heyecanlanabilirliğini ve sinaptik yanıtları etkileyen kötüye 12-15 ilaçlara yanıt kurulmasında başlıca role sahiptir. Nöronal kaçakçılığı çalışmaların çoğunluğu heterolog ekspresyon sistemleri veya kültür birincil nöronlar ya güveniyor Bugüne kadar, ikisi de güvenilir bir yetişkin nöronların oynayan mekanizmaları yansıtıyor olabilir. Burada, sayısal olarak yetişkin kemirgenlerden türetilen akut beyin dilimleri yüzey proteini seviyelerini ölçmek için yüzey biyotinilasyonunu kullanan bir yaklaşım sunulmuştur. Bu yaklaşımı kullanarak, fare striatal dopamin taşıyıcısı hızla re içselleştirilmesini göstermek veri mevcutforbol ester-kaynaklı protein kinaz C (PKC) aktivasyonu için tepkisi uyarma.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beyinde kritik etkileri sinaptik sinyal endositik kaçakçılığı, kantitatif yetişkin nöronlarda protein yüzey ifade değişikliklerini ölçmek için zor kanıtlamıştır uzun zamandır bilgimiz rağmen. Bu çalışmada, akut beyin dilimleri yüzey proteini ex vivo etiketlemek için güvenilir bir yaklaşım rapor. Sinaptik bağlantıları ve bunların hazırlanması saat sonra hücre canlılığı muhafaza edilmesi gibi beyin dilim hazırlıkları, elektrofizyolojik kayıtlar için yarar bir süredir d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma HEM NIH hibe DA15169 ve DA035224 tarafından finanse edildi
Materials
| sulfo NHS-SS-biotin | Pierce | 21331 | |
| Streptavidin agarose | Pierce | 20347 | |
| IgG-free, Protease-free Bovine serum albumin | Sigma | A3059 | |
| Vibrating microtome sectioner | Various | ||
| Shaking water bath | various | ||
| Milli-cell mesh-bottomed inserts (8µm pore size) | Millipore | PI8P 012 50 | These can be washed by hand and re-used |
References
- Conner, S. D., Schmid, S. L. Regulated portals of entry into the cell. Nature. 422, 37-44 (2003).
- Zastrow, M., Williams, J. T. Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway. Neuron. 76, 22-32 (2012).
- Leto, D., Saltiel, A. R. Regulation of glucose transport by insulin: traffic control of GLUT4. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13, 383-396 (2012).
- Liu, Y. W., Lukiyanchuk, V., Schmid, S. L. Common membrane trafficking defects of disease-associated dynamin 2 mutations. Traffic. 12, 1620-1633 (2011).
- Li, X., DiFiglia, M. The recycling endosome and its role in neurological disorders. Prog. Neurobiol. , 127-141 (2012).
- Sandvig, K., Pust, S., Skotland, T., van Deurs, B. Clathrin-independent endocytosis: mechanisms and function. Curr. Opin. Cell Biol. 23, 413-420 (2011).
- Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Res. 20, 256-275 (2010).
- Barry, M. F., Ziff, E. B. Receptor trafficking and the plasticity of excitatory synapses. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 279-286 (2002).
- Bredt, D. S., Nicoll, R. A. AMPA receptor trafficking at excitatory synapses. Neuron. 40, 361-379 (2003).
- Kerchner, G. A., Nicoll, R. A. Silent synapses and the emergence of a postsynaptic mechanism for LTP. Nat. Rev. Neurosci. 9, 813-825 (2008).
- Malinow, R., Malenka, R. C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annu. Rev. Neurosci. 25, 103-126 (2002).
- Borgland, S. L., Malenka, R. C., Bonci, A. Acute and chronic cocaine-induced potentiation of synaptic strength in the ventral tegmental area: electrophysiological and behavioral correlates in individual rats. J. Neurosci. 24, 7482-7490 (2004).
- Dong, Y., et al. Cocaine-induced potentiation of synaptic strength in dopamine neurons: Behavioral correlates in GluRA(-/-) mice. PNAS. 101, 14282-14287 (2004).
- Hyman, S. E., Malenka, R. C., Nestler, E. J. Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory. Annu. Rev. Neurosci. 29, 565-598 (2006).
- Thomas, M. J., Malenka, R. C. Synaptic plasticity in the mesolimbic dopamine system. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358, 815-819 (2003).
- Sorkina, T., Hoover, B. R., Zahniser, N. R., Sorkin, A. Constitutive and protein kinase C-induced internalization of the dopamine transporter is mediated by a clathrin-dependent mechanism. Traffic. 6, 157-170 (2005).
- Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. Nonclassical, distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization. Nat. Neurosci. 8, 881-888 (2005).
- Loder, M. K., Melikian, H. E. The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines. J. Biol. Chem. 278, 22168-22174 (2003).
- Melikian, H. E., Buckley, K. M. Membrane trafficking regulates the activity of the human dopamine transporter. J. Neurosci. 19, 7699-7710 (1999).
- Daniels, G. M., Amara, S. G. Regulated trafficking of the human dopamine transporter. Clathrin-mediated internalization and lysosomal degradation in response to phorbol esters. J. Biol. Chem. 274, 35794-35801 (1999).
- Sorkina, T., et al. RNA interference screen reveals an essential role of Nedd4-2 in dopamine transporter ubiquitination and endocytosis. J. Neurosci. 26, 8195-8205 (2006).
- Eriksen, J., et al. Visualization of dopamine transporter trafficking in live neurons by use of fluorescent cocaine analogs. J. Neurosci. 29, 6794-6808 (2009).
- Rao, A., Simmons, D., Sorkin, A. Differential subcellular distribution of endosomal compartments and the dopamine transporter in dopaminergic neurons. Mol. Cell Neurosci. 46, 148-158 (2011).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8, 745-752 (2011).
