Мозг Slice Биотинилирование:<em> Экс Vivo</em> Подход к Измерьте Регион-специфический плазменным мембранный белок с торговлей взрослых нейронов
Summary
Нейронов торговля мембрана динамически управляет ПЛАЗМАЛЕММЫ наличие белка и существенно влияет нейротрансмиссию. На сегодняшний день, это была сложной для измерения нейронов эндоцитического торговлей взрослых нейронов. Здесь мы описываем высокоэффективную, количественный метод измерения быстрые изменения в экспрессии белка поверхности экс естественных условиях в острых срезах мозга.
Abstract
Регулируемый эндоцитотический торговля является центральным механизмом содействия разнообразные нейромодуляторного событий, за счет динамического управления рецептор, ионный канал, и представление транспортера клеточной поверхностью на минут масштабе времени. Существует широкий разнообразие механизмов, которые контролируют эндоцитического оборотом отдельных белков. Исследования следственные молекулярные основы торговли были в первую очередь полагаться на поверхности биотинилирования количественно измерить изменения в экспрессии поверхностных мембранных белков в ответ на экзогенные стимулы и генной инженерии. Тем не менее, этот подход был в основном ограничивается культивируемых клеток, которые не могут добросовестно отражают физиологически соответствующие механизмы на игре у взрослых нейронов. Кроме того, культурные подходы клеток может привести к недооценке региональной специфики различия в механизмах торговли людьми. Здесь мы описываем подход, который простирается на клеточной поверхности биотинилирование к острой подготовки мозга среза. Мыпоказывают, что этот метод обеспечивает высококачественный подход для измерения быстрые изменения в поверхностных уровней мембранного белка у взрослых нейронов. Такой подход, вероятно, находят широкое применение в области нейронов эндоцитотического людьми.
Introduction
Эндоцитотических торговля является повсеместное клеточный механизм, что точно настраивает ПЛАЗМАЛЕММЫ презентация различных интегральных мембранных белков. Эндоцитоз обеспечивает жизненно важных питательных веществ к внутриклеточной среде 1 и уменьшает чувствительность рецепторов сигналов в ответ на активацию рецепторов 2. Эндоцитотических утилизации обратно в мембране может дополнительно повысить клеточную сигнализацию за счет увеличения уровня экспрессии белка на клеточной поверхности 3. Кроме того, возмущения с торговлей людьми мембраны вовлечены в многочисленные заболевания и патологические состояния, 4,5, подчеркнув необходимость расследовать молекулярные механизмы, которые регулируют белковый торговлей эндоцитического. В то время как многие белки используют классические клатрином зависит интернализации механизмы, монтажные доказательства в течение последних нескольких лет показывает, что несколько клатрином независимым эндоцитотических механизмы регулируют эндоцитического потенциал растущего массивабелки 6,7. Таким образом, необходимость исследовать эндоцитотических механизмы, облегчающие торговлей физиологических соответствующих систем значительно вырос.
В мозге, эндоцитотический торговля рецепторов, ионных каналов и нейромедиаторов перевозчиков имеет первостепенную роль в создании синаптическую пластичность 8-11 и реагирования на наркотики 12-15, в конечном счете, влияющих возбудимость нейронов и синаптических ответов. На сегодняшний день большинство исследований нейронных торговли людьми полагаться либо на гетерологичными систем экспрессии или культивируемых первичных нейронов, ни один из которых может надежно отражают механизмы на игре у взрослых нейронов. Здесь мы сообщаем подход, который использует поверхностную биотинилирование количественно измерить уровни поверхностного белка в острых срезах мозга, полученных из взрослых грызунов. Используя этот подход, мы представляем данные, демонстрирующие, что мышь полосатой переносчиков дофамина быстро усваивает в реОтклик на форболового эфира опосредованного протеинкиназы С (РКС) активации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Несмотря на многолетний знаний, которые эндоцитотический оборот критически воздействия синаптической передачи сигналов в мозге, она оказалась сложной для количественного измерения изменения в экспрессии поверхностных белков у взрослых нейронов. В этой работе мы сообщаем надежный п…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась за счет грантов НИЗ DA15169 и DA035224 в HEM
Materials
| sulfo NHS-SS-biotin | Pierce | 21331 | |
| Streptavidin agarose | Pierce | 20347 | |
| IgG-free, Protease-free Bovine serum albumin | Sigma | A3059 | |
| Vibrating microtome sectioner | Various | ||
| Shaking water bath | various | ||
| Milli-cell mesh-bottomed inserts (8µm pore size) | Millipore | PI8P 012 50 | These can be washed by hand and re-used |
References
- Conner, S. D., Schmid, S. L. Regulated portals of entry into the cell. Nature. 422, 37-44 (2003).
- Zastrow, M., Williams, J. T. Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway. Neuron. 76, 22-32 (2012).
- Leto, D., Saltiel, A. R. Regulation of glucose transport by insulin: traffic control of GLUT4. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13, 383-396 (2012).
- Liu, Y. W., Lukiyanchuk, V., Schmid, S. L. Common membrane trafficking defects of disease-associated dynamin 2 mutations. Traffic. 12, 1620-1633 (2011).
- Li, X., DiFiglia, M. The recycling endosome and its role in neurological disorders. Prog. Neurobiol. , 127-141 (2012).
- Sandvig, K., Pust, S., Skotland, T., van Deurs, B. Clathrin-independent endocytosis: mechanisms and function. Curr. Opin. Cell Biol. 23, 413-420 (2011).
- Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Res. 20, 256-275 (2010).
- Barry, M. F., Ziff, E. B. Receptor trafficking and the plasticity of excitatory synapses. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 279-286 (2002).
- Bredt, D. S., Nicoll, R. A. AMPA receptor trafficking at excitatory synapses. Neuron. 40, 361-379 (2003).
- Kerchner, G. A., Nicoll, R. A. Silent synapses and the emergence of a postsynaptic mechanism for LTP. Nat. Rev. Neurosci. 9, 813-825 (2008).
- Malinow, R., Malenka, R. C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annu. Rev. Neurosci. 25, 103-126 (2002).
- Borgland, S. L., Malenka, R. C., Bonci, A. Acute and chronic cocaine-induced potentiation of synaptic strength in the ventral tegmental area: electrophysiological and behavioral correlates in individual rats. J. Neurosci. 24, 7482-7490 (2004).
- Dong, Y., et al. Cocaine-induced potentiation of synaptic strength in dopamine neurons: Behavioral correlates in GluRA(-/-) mice. PNAS. 101, 14282-14287 (2004).
- Hyman, S. E., Malenka, R. C., Nestler, E. J. Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory. Annu. Rev. Neurosci. 29, 565-598 (2006).
- Thomas, M. J., Malenka, R. C. Synaptic plasticity in the mesolimbic dopamine system. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358, 815-819 (2003).
- Sorkina, T., Hoover, B. R., Zahniser, N. R., Sorkin, A. Constitutive and protein kinase C-induced internalization of the dopamine transporter is mediated by a clathrin-dependent mechanism. Traffic. 6, 157-170 (2005).
- Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. Nonclassical, distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization. Nat. Neurosci. 8, 881-888 (2005).
- Loder, M. K., Melikian, H. E. The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines. J. Biol. Chem. 278, 22168-22174 (2003).
- Melikian, H. E., Buckley, K. M. Membrane trafficking regulates the activity of the human dopamine transporter. J. Neurosci. 19, 7699-7710 (1999).
- Daniels, G. M., Amara, S. G. Regulated trafficking of the human dopamine transporter. Clathrin-mediated internalization and lysosomal degradation in response to phorbol esters. J. Biol. Chem. 274, 35794-35801 (1999).
- Sorkina, T., et al. RNA interference screen reveals an essential role of Nedd4-2 in dopamine transporter ubiquitination and endocytosis. J. Neurosci. 26, 8195-8205 (2006).
- Eriksen, J., et al. Visualization of dopamine transporter trafficking in live neurons by use of fluorescent cocaine analogs. J. Neurosci. 29, 6794-6808 (2009).
- Rao, A., Simmons, D., Sorkin, A. Differential subcellular distribution of endosomal compartments and the dopamine transporter in dopaminergic neurons. Mol. Cell Neurosci. 46, 148-158 (2011).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8, 745-752 (2011).
