मस्तिष्क टुकड़ा Biotinylation: एक<em> पूर्व vivo</emवयस्क न्यूरॉन्स में क्षेत्र विशेष के प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन की तस्करी करने के लिए उपाय> दृष्टिकोण
Summary
Neuronal झिल्ली तस्करी को गतिशील प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन की उपलब्धता और काफी प्रभाव डालता है neurotransmission नियंत्रित करता है. तिथि करने के लिए, यह वयस्क न्यूरॉन्स में neuronal endocytic तस्करी को मापने के लिए चुनौती रहा है. यहाँ, हम तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें में सतह प्रोटीन अभिव्यक्ति पूर्व vivo में तेजी से बदलाव को मापने के लिए एक अत्यधिक प्रभावी, मात्रात्मक विधि का वर्णन.
Abstract
नियमित endocytic तस्करी गतिशील रूप से एक मिनट के समय के पैमाने पर रिसेप्टर, आयन चैनल, और ट्रांसपोर्टर कोशिका की सतह प्रस्तुति को नियंत्रित करके, neuromodulatory घटनाओं की एक किस्म की सुविधा केंद्रीय तंत्र है. व्यक्ति प्रोटीन की endocytic तस्करी कि नियंत्रण तंत्र की एक व्यापक विविधता है. तस्करी के आणविक आधार की जांच के अध्ययन मुख्य रूप से मात्रात्मक एक्सोजेनस उत्तेजनाओं और जीन में गड़बड़ी के जवाब में झिल्ली प्रोटीन सतह अभिव्यक्ति में परिवर्तन को मापने के लिए सतह biotinylation पर भरोसा किया है. हालांकि, इस दृष्टिकोण को मुख्य रूप से ईमानदारी से वयस्क न्यूरॉन्स में खेलने पर physiologically प्रासंगिक तंत्र शामिल न हों जो सभ्य कोशिकाओं तक ही सीमित कर दिया गया है. इसके अलावा, सुसंस्कृत सेल दृष्टिकोण तस्करी तंत्र में क्षेत्र विशेष के मतभेदों को नजरअंदाज कर सकते हैं. यहाँ, हम तीव्र मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी के लिए कोशिका की सतह biotinylation फैली कि एक दृष्टिकोण का वर्णन. हमइस विधि वयस्क न्यूरॉन्स में झिल्ली प्रोटीन सतह के स्तर में तेजी से बदलाव को मापने के लिए एक उच्च निष्ठा दृष्टिकोण प्रदान करता है कि प्रदर्शित करता है. यह दृष्टिकोण neuronal endocytic तस्करी के क्षेत्र में व्यापक उपयोगिता है की संभावना है.
Introduction
Endocytic तस्करी अभिन्न झिल्ली प्रोटीन की एक किस्म के प्लाज्मा झिल्ली प्रस्तुति ठीक धुनों कि एक सर्वव्यापी सेलुलर तंत्र है. Endocytosis intracellular परिवेश 1 के लिए महत्वपूर्ण पोषक तत्वों उद्धार और रिसेप्टर सक्रियण 2 के जवाब में रिसेप्टर संकेतन desensitizes. वापस प्लाज्मा झिल्ली रीसाइक्लिंग endocytic अतिरिक्त कोशिका की सतह 3 में प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर में वृद्धि से सेलुलर संकेत वृद्धि कर सकते हैं. इसके अलावा, झिल्ली तस्करी perturbations प्रोटीन endocytic तस्करी कि सरकार आणविक तंत्र की जांच करने की आवश्यकता पर बल देते हुए, कई रोग और रोग की स्थिति 4,5 में फंसा रहे हैं. कई प्रोटीन पिछले कई वर्षों से सबूत बढ़ते क्लासिक क्लैथ्रिन पर निर्भर internalization तंत्र का उपयोग करते समय कई क्लैथ्रिन स्वतंत्र endocytic तंत्र की एक बढ़ती हुई सरणी के endocytic संभावित है कि सरकार को दर्शाता हैप्रोटीन 6,7. इस प्रकार, शारीरिक प्रासंगिक प्रणालियों में तस्करी की सुविधा endocytic तंत्र की जांच करने की आवश्यकता काफी वृद्धि हुई है.
मस्तिष्क में रिसेप्टर्स, आयन चैनलों और neurotransmitter ट्रांसपोर्टरों की endocytic तस्करी synaptic plasticity 8-11 और अंततः neuronal excitability और synaptic प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करें 12-15 की दवाओं, के जवाब स्थापित करने में एक प्राथमिक भूमिका है. Neuronal तस्करी पढ़ाई के बहुमत heterologous अभिव्यक्ति सिस्टम या सुसंस्कृत प्राथमिक न्यूरॉन्स या तो पर भरोसा आज तक, न तो जिनमें से मज़बूती से वयस्क न्यूरॉन्स में खेलने पर तंत्र को प्रतिबिंबित कर सकते. यहाँ, हम मात्रात्मक वयस्क कृन्तकों से व्युत्पन्न तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें में सतह प्रोटीन के स्तर को मापने के लिए सतह biotinylation का उपयोग करता है एक दृष्टिकोण है कि रिपोर्ट. इस दृष्टिकोण का प्रयोग, हम माउस स्ट्रिआटल डोपामाइन ट्रांसपोर्टर तेजी से पुनः में internalizes कि दिखाना है कि आंकड़ों को पेशphorbol एस्टर की मध्यस्थता प्रोटीन kinase सी (पीकेसी) सक्रियण के लिए त्वरित कार्रवाई.
Protocol
Representative Results
Discussion
मस्तिष्क में गंभीर रूप से प्रभाव डालता है synaptic संकेतन endocytic तस्करी, यह मात्रात्मक वयस्क न्यूरॉन्स में प्रोटीन सतह अभिव्यक्ति में परिवर्तन को मापने के लिए चुनौतीपूर्ण साबित कर दिया है कि लम्बे समय से जान?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम हेम को एनआईएच अनुदान DA15169 और DA035224 द्वारा वित्त पोषित किया गया
Materials
| sulfo NHS-SS-biotin | Pierce | 21331 | |
| Streptavidin agarose | Pierce | 20347 | |
| IgG-free, Protease-free Bovine serum albumin | Sigma | A3059 | |
| Vibrating microtome sectioner | Various | ||
| Shaking water bath | various | ||
| Milli-cell mesh-bottomed inserts (8µm pore size) | Millipore | PI8P 012 50 | These can be washed by hand and re-used |
References
- Conner, S. D., Schmid, S. L. Regulated portals of entry into the cell. Nature. 422, 37-44 (2003).
- Zastrow, M., Williams, J. T. Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway. Neuron. 76, 22-32 (2012).
- Leto, D., Saltiel, A. R. Regulation of glucose transport by insulin: traffic control of GLUT4. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13, 383-396 (2012).
- Liu, Y. W., Lukiyanchuk, V., Schmid, S. L. Common membrane trafficking defects of disease-associated dynamin 2 mutations. Traffic. 12, 1620-1633 (2011).
- Li, X., DiFiglia, M. The recycling endosome and its role in neurological disorders. Prog. Neurobiol. , 127-141 (2012).
- Sandvig, K., Pust, S., Skotland, T., van Deurs, B. Clathrin-independent endocytosis: mechanisms and function. Curr. Opin. Cell Biol. 23, 413-420 (2011).
- Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Res. 20, 256-275 (2010).
- Barry, M. F., Ziff, E. B. Receptor trafficking and the plasticity of excitatory synapses. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 279-286 (2002).
- Bredt, D. S., Nicoll, R. A. AMPA receptor trafficking at excitatory synapses. Neuron. 40, 361-379 (2003).
- Kerchner, G. A., Nicoll, R. A. Silent synapses and the emergence of a postsynaptic mechanism for LTP. Nat. Rev. Neurosci. 9, 813-825 (2008).
- Malinow, R., Malenka, R. C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annu. Rev. Neurosci. 25, 103-126 (2002).
- Borgland, S. L., Malenka, R. C., Bonci, A. Acute and chronic cocaine-induced potentiation of synaptic strength in the ventral tegmental area: electrophysiological and behavioral correlates in individual rats. J. Neurosci. 24, 7482-7490 (2004).
- Dong, Y., et al. Cocaine-induced potentiation of synaptic strength in dopamine neurons: Behavioral correlates in GluRA(-/-) mice. PNAS. 101, 14282-14287 (2004).
- Hyman, S. E., Malenka, R. C., Nestler, E. J. Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory. Annu. Rev. Neurosci. 29, 565-598 (2006).
- Thomas, M. J., Malenka, R. C. Synaptic plasticity in the mesolimbic dopamine system. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358, 815-819 (2003).
- Sorkina, T., Hoover, B. R., Zahniser, N. R., Sorkin, A. Constitutive and protein kinase C-induced internalization of the dopamine transporter is mediated by a clathrin-dependent mechanism. Traffic. 6, 157-170 (2005).
- Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. Nonclassical, distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization. Nat. Neurosci. 8, 881-888 (2005).
- Loder, M. K., Melikian, H. E. The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines. J. Biol. Chem. 278, 22168-22174 (2003).
- Melikian, H. E., Buckley, K. M. Membrane trafficking regulates the activity of the human dopamine transporter. J. Neurosci. 19, 7699-7710 (1999).
- Daniels, G. M., Amara, S. G. Regulated trafficking of the human dopamine transporter. Clathrin-mediated internalization and lysosomal degradation in response to phorbol esters. J. Biol. Chem. 274, 35794-35801 (1999).
- Sorkina, T., et al. RNA interference screen reveals an essential role of Nedd4-2 in dopamine transporter ubiquitination and endocytosis. J. Neurosci. 26, 8195-8205 (2006).
- Eriksen, J., et al. Visualization of dopamine transporter trafficking in live neurons by use of fluorescent cocaine analogs. J. Neurosci. 29, 6794-6808 (2009).
- Rao, A., Simmons, D., Sorkin, A. Differential subcellular distribution of endosomal compartments and the dopamine transporter in dopaminergic neurons. Mol. Cell Neurosci. 46, 148-158 (2011).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8, 745-752 (2011).
