Brain Slice Biotinylatie: An<em> Ex Vivo</em> Aanpak Regiospecifieke van plasma membraaneiwit Trafficking Meet in Adult Neuronen
Summary
Neuronale membraan mensenhandel stelt dynamisch plasmamembraaneiwit beschikbaarheid en significant invloed neurotransmissie. Tot op heden, is het een uitdaging om neuronale endocytische handel in volwassen neuronen te meten. Hier beschrijven we een zeer effectieve, kwantitatieve methode om snelle veranderingen in de oppervlakte-eiwit expressie ex vivo bij acute plakjes hersenen te meten.
Abstract
Gereglementeerde endocytische mensenhandel is het centrale mechanisme faciliteren van een verscheidenheid van neuromodulatory gebeurtenissen, door het dynamisch regelen van receptor, ionkanalen en vervoerder oppervlak cel presentatie op een minuten tijdschaal. Er is een grote diversiteit van mechanismen die endocytisch handel in individuele eiwitten controleren. Studies die de moleculaire onderbouwing van mensenhandel hebben voornamelijk ingeroepen oppervlak biotinylatie om kwantitatief veranderingen in membraaneiwit oppervlakte-expressie te meten in reactie op exogene prikkels en genetische manipulatie. Echter, deze benadering is voornamelijk beperkt tot gekweekte cellen, die niet trouw kunnen weerspiegelen de fysiologisch relevante mechanismen die een rol spelen bij volwassen neuronen. Bovendien kan gekweekte cel benaderingen regio-specifieke verschillen in de handel mechanismen onderschatten. Hier beschrijven we een aanpak die celoppervlak biotinylering uitstrekt tot de acute hersenen slice voorbereiding. Wijaantonen dat deze methode zorgt voor een high-fidelity aanpak van snelle veranderingen in de membraan eiwitoppervlak niveaus in volwassen neuronen te meten. Deze benadering is waarschijnlijk brede bruikbaarheid op het gebied van neuronale endocytische handel hebben.
Introduction
Endocytische mensenhandel is een alomtegenwoordige cellulair mechanisme dat verfijnt de plasmamembraan presentatie van een verscheidenheid van integrale membraaneiwitten. Endocytosis levert vitale voedingsstoffen aan het intracellulaire milieu 1 en ongevoelig receptor signalering in respons op receptoractivering 2. Endocytische recycling terug naar de plasmamembraan kan bovendien versterken cellulaire signalering door verhogend eiwit expressie op het celoppervlak 3. Bovendien worden membraantransport verstoringen betrokken bij tal van ziekten en pathologische omstandigheden 4,5, gewezen op de noodzaak om de moleculaire mechanismen die eiwit endocytische mensenhandel regeren onderzoeken. Hoewel veel eiwitten gebruiken klassieke clathrin-afhankelijke internalisatie mechanismen, steeds meer aanwijzingen over de afgelopen jaren laat zien dat meerdere clathrin-onafhankelijke endocytische mechanismen regelen de endocytische potentieel van een toenemende aanbod vaneiwitten 6,7. Zo heeft de noodzaak om endocytische mechanismen vergemakkelijken handel in fysiologisch relevante systemen te onderzoeken flink gegroeid.
In de hersenen, endocytische mensenhandel van receptoren, ionkanalen en neurotransmitter transporters heeft een primaire rol bij het vaststellen van synaptische plasticiteit 8-11 en de reactie op drugs 12-15, uiteindelijk invloed neuronale prikkelbaarheid en synaptische reacties. Tot dusver heeft de meerderheid van de neuronale mensenhandel studies beroepen op heterologe expressie systemen of gekweekte primaire neuronen, die geen van beide kan een getrouw beeld geven mechanismen een rol spelen bij volwassen neuronen. Hier melden wij een aanpak die oppervlak biotinylatie gebruikt om oppervlakte-eiwit niveaus in acute hersenenplakken afgeleid van volwassen knaagdieren kwantitatief te meten. Met deze aanpak, presenteren we data die aantonen dat de muis striatale dopamine transporter snel internaliseert in rereactie op forbol-ester gemedieerde proteïne kinase C (PKC) activatie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ondanks jarenlange kennis die endocytische mensenhandel kritisch gevolgen synaptische signalering in de hersenen, het is een uitdaging om kwantitatief veranderingen in eiwitoppervlak expressie in volwassen neuronen meten bewezen. In dit werk, melden wij een betrouwbare benadering van oppervlakte-eiwit ex vivo labelen in acute hersenen plakjes. Hersenen slice preparaten hebben een jarenlange geschiedenis van nut voor elektrofysiologische opnames, omdat ze onderhouden synaptische verbindingen en mobiele levensvat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door NIH subsidies DA15169 en DA035224 om HEM
Materials
| sulfo NHS-SS-biotin | Pierce | 21331 | |
| Streptavidin agarose | Pierce | 20347 | |
| IgG-free, Protease-free Bovine serum albumin | Sigma | A3059 | |
| Vibrating microtome sectioner | Various | ||
| Shaking water bath | various | ||
| Milli-cell mesh-bottomed inserts (8µm pore size) | Millipore | PI8P 012 50 | These can be washed by hand and re-used |
References
- Conner, S. D., Schmid, S. L. Regulated portals of entry into the cell. Nature. 422, 37-44 (2003).
- Zastrow, M., Williams, J. T. Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway. Neuron. 76, 22-32 (2012).
- Leto, D., Saltiel, A. R. Regulation of glucose transport by insulin: traffic control of GLUT4. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13, 383-396 (2012).
- Liu, Y. W., Lukiyanchuk, V., Schmid, S. L. Common membrane trafficking defects of disease-associated dynamin 2 mutations. Traffic. 12, 1620-1633 (2011).
- Li, X., DiFiglia, M. The recycling endosome and its role in neurological disorders. Prog. Neurobiol. , 127-141 (2012).
- Sandvig, K., Pust, S., Skotland, T., van Deurs, B. Clathrin-independent endocytosis: mechanisms and function. Curr. Opin. Cell Biol. 23, 413-420 (2011).
- Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Res. 20, 256-275 (2010).
- Barry, M. F., Ziff, E. B. Receptor trafficking and the plasticity of excitatory synapses. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 279-286 (2002).
- Bredt, D. S., Nicoll, R. A. AMPA receptor trafficking at excitatory synapses. Neuron. 40, 361-379 (2003).
- Kerchner, G. A., Nicoll, R. A. Silent synapses and the emergence of a postsynaptic mechanism for LTP. Nat. Rev. Neurosci. 9, 813-825 (2008).
- Malinow, R., Malenka, R. C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annu. Rev. Neurosci. 25, 103-126 (2002).
- Borgland, S. L., Malenka, R. C., Bonci, A. Acute and chronic cocaine-induced potentiation of synaptic strength in the ventral tegmental area: electrophysiological and behavioral correlates in individual rats. J. Neurosci. 24, 7482-7490 (2004).
- Dong, Y., et al. Cocaine-induced potentiation of synaptic strength in dopamine neurons: Behavioral correlates in GluRA(-/-) mice. PNAS. 101, 14282-14287 (2004).
- Hyman, S. E., Malenka, R. C., Nestler, E. J. Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory. Annu. Rev. Neurosci. 29, 565-598 (2006).
- Thomas, M. J., Malenka, R. C. Synaptic plasticity in the mesolimbic dopamine system. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358, 815-819 (2003).
- Sorkina, T., Hoover, B. R., Zahniser, N. R., Sorkin, A. Constitutive and protein kinase C-induced internalization of the dopamine transporter is mediated by a clathrin-dependent mechanism. Traffic. 6, 157-170 (2005).
- Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. Nonclassical, distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization. Nat. Neurosci. 8, 881-888 (2005).
- Loder, M. K., Melikian, H. E. The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines. J. Biol. Chem. 278, 22168-22174 (2003).
- Melikian, H. E., Buckley, K. M. Membrane trafficking regulates the activity of the human dopamine transporter. J. Neurosci. 19, 7699-7710 (1999).
- Daniels, G. M., Amara, S. G. Regulated trafficking of the human dopamine transporter. Clathrin-mediated internalization and lysosomal degradation in response to phorbol esters. J. Biol. Chem. 274, 35794-35801 (1999).
- Sorkina, T., et al. RNA interference screen reveals an essential role of Nedd4-2 in dopamine transporter ubiquitination and endocytosis. J. Neurosci. 26, 8195-8205 (2006).
- Eriksen, J., et al. Visualization of dopamine transporter trafficking in live neurons by use of fluorescent cocaine analogs. J. Neurosci. 29, 6794-6808 (2009).
- Rao, A., Simmons, D., Sorkin, A. Differential subcellular distribution of endosomal compartments and the dopamine transporter in dopaminergic neurons. Mol. Cell Neurosci. 46, 148-158 (2011).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8, 745-752 (2011).
