הערכת התפתחותם של תאי Murine Plasmacytoid דנדריטים בתיקונים של Peyer באמצעות העברת מאמצת של אבות Hematopoietic
Summary
פרוטוקול זה מתאר הפרוצדורות על מנת להעריך את ההתמיינות של תאים הדנדריטים plasmacytoid בתיקון של Peyer מאבות תא הדנדריטי משותפים, תוך שימוש בטכניקות הכוללות בידוד בתיווך FACS תא, העברת גנים הידרודינמית, וניתוח זרימה של תת חיסון בתיקון של Peyer.
Abstract
פרוטוקול זה מפרט שיטה לנתח את היכולת של אבות היווצרות הדם מטוהרים כדי ליצור תאים דנדריטים plasmacytoid (PDC) בתיקון של Peyer מעיים (PP). אבות תאים דנדריטים משותפים (CDPs, לין – c-kit lo CD115 + FLT3 +) היו מטוהרים ממח העצם של עכברי C57BL6 ידי FACS והועברו לעכברי נמען שאין אוכלוסיית PDC משמעותית בPP, במקרה זה, Ifnar – / – עכברים שימשו כמקבלי העברה. בחלק מהעכברים, ביטוי יתר של גורם גדילה ליגנד תאים דנדריטים FLT3 (Flt3L) נאכף לפני מאמצי העברת CDPs, באמצעות העברת גנים הידרודינמית (HGT) של פלסמיד Flt3L הקידוד. ביטוי יתר Flt3L מרחיב אוכלוסיות DC מקורם אבות הועברו (או אנדוגני) hematopoietic. ב7-10 ימים לאחר העברת אב, pDCs שעולה מהאבות העבירו adoptively נבדלו מתאי נמען עלבסיס של ביטוי סמן CD45, עם pDCs מCDPs הועבר להיות CD45.1 + ומקבלי להיות + CD45.2. היכולת של CDPs הועבר לתרום לאוכלוסיית PDC בPP ולהגיב לFlt3L הוערכה על ידי cytometry זרימה של השעיות תא בודדות PP מעכברי נמען. בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לבדוק אם אוכלוסיות אב אחרות הן מסוגלים לייצר PP pDCs. בנוסף, גישה זו יכולה לשמש כדי לבחון את התפקיד של גורמים שהם חזו להשפיע על התפתחות PDC בPP, על ידי העברה תת אב עם מציאה מתאימה, נוקאאוט או ביטוי יתר של הגורם ו / או התפתחותי המשוערת על ידי מניפולציה ציטוקינים במחזור באמצעות HGT . שיטה זו גם עשויה לאפשר ניתוח של כמה pDCs PP משפיע על התדירות או פונקציה של תת חיסון אחר בPPS. תכונה ייחודית של שיטה זו היא השימוש בIfnar – / – עכברים, אשר מראה מדולדל קשות ביחס PP pDCs לבעלי חיים מסוג בר, ובכך allowiהכינון מחדש ng של PP pDCs בהעדר תופעות של בלבול מקרינה קטלנית.
Introduction
הנה, אנחנו מדגימים פרוטוקול להעריך האם אבות תאים דנדריטים משותפים (CDPs) מסוגלים לתת עלייה לתאים דנדריטים plasmacytoid אוכלוסייה (PDC) בתיקון של Peyer (PP). המטרה הכללית של שימוש בשיטה זו הייתה להעריך את הרגולציה ההתפתחותי של pDCs בתיקון של Peyer (PP PDC). מהסיבה זו חשובה היא שpDCs PP שונה מpDCs נמצא ברקמות אחרות, כוללים מח עצם, דם וטחול, ולכן לא ברור אם pDCs PP ואוכלוסיות PDC אחרות הן מבחינה התפתחותית ו / או תפקודי בנושא. באופן ספציפי, pDCs ידוע נרחב על היותו הסוג העיקרי אני אינטרפרון מפיקים (IFN) בתוך מערכת hematopoietic, בתגובה לחיוג כמו קולטן 7 ו 9 גירוי (TLR7 / 9) על ידי מהיר IFN ההפרשה 1-3. יחד עם זאת, pDCs PP חסר בייצור הסוג אני IFN בתגובה לגירוי 4,5 אגוניסט TLR. זאת ועוד, PP pDCs גם שונה מpDCs נמצא במח עצם וטחול בהדורש אותות מהסוג אני אינטרפרון רצפטור (IFN) (IFNAR1) או IFN איתות STAT1 מולקולה לפיתוח ו / או ההצטברות 5 שלהם. נתונים אלה הציעו את האפשרות שמנגנוני פיקוח שונים לשלוט pDCs PP לעומת pDCs באיברים אחרים (למשל מח עצם, טחול) 5.
הרציונל שהוביל לפיתוחה של שיטה זו היה מבוסס על ההתקדמות בהבנת ביולוגיה של תאים דנדריטים (DC). רוב, אם לא כולם, תת DC נובעים מאבות hematopoietic המבטאים את FMS-כמו טירוזין קינאז 3 קולט (FLT3) 6-10, עם זאת, פיתוח DC אינו מוגבל למיאלואידית הקלאסית ומסלולי הלימפה. לדוגמא, + אבות FLT3 נפוצים מיאלואידית (CMPs, לין – IL-7R – SCA-1 – c-kit + CD34 + FcγR lo / -) להצמיח CDPs (לין – c-kit lo CD115 + FLT3 +), אשרשעות נוספות להבדיל לpDCs וDCs הקונבנציונלי (cDCs) 9,10. לעומת זאת, FLT3 + אבות הלימפה נפוצים (CLPs, לין – והנה + SCA-1 lo c-kit IL-7R) לפתח בעיקר לpDCs 11. לכן, מחקרים קודמים מצביעים על pDCs לנבוע מלפחות 2 אוכלוסיות אבות היווצרות הדם נפרדות לפי תקנה של Flt3L, אם כי הניתוח הטיפוסי הוגבל למח עצם, הטחול ו / או תת PDC הדם. לכן, אוכלוסיית האב (ים) שיוצרת PP pDCs נדרשת חקירה. הבנת מקורותיה של PP pDCs תשפוך אור על השאלה האם הם חולקים מסלולים התפתחותיים משותפים עם אוכלוסיות PDC אחרות, או לנצל את המנגנונים שונים בדורם בPP.
יתרון ייחודי של הגישה המתוארת כאן הוא השימוש בעכברים מראים כי מחסור חמור בPP pDCs כנמענים להעברת המאמצת של אבות היווצרות הדם. עכברים עם גןמחיקת טיק בגן המקודד IFNAR1 (Ifnar – / – עכברים) או STAT1 (Stat1 – / -) גילתה דלדול בולט בPP pDCs 5. לכן, זנים אלה מספקים סביבה שבה pDCs PP מופחתים, המאפשרים לימודי העברת מאמצת שיש לבצע בהיעדר משטרי אבלציה הסלולרי חזקים כמו קרינה קטלנית. כוח נוסף של השיטה המוצגת כאן הוא השימוש בהעברת גנים הידרודינמית (HGT) כדי לעורר את הכמויות במחזור גבוהות של Flt3L. זה מספק גישה יעילה עלות לגרום Flt3L in vivo, לעומת הזרקה של חלבון רקומביננטי. מחקרים רבים, כוללים אלה במעבדה שלנו, יש מועסקי HGT לגרום כמויות ציטוקינים במגוון רחב של תנאי ניסוי 5,12,13.
חלוקת העבודה ותפקידים חיסוניים מדויקים לDCS היא עניין המרכזי באימונולוגיה. בפרט, pDCs הם מתווכים חשובים של סובלנות אוראלית ואנטי ויראלית המערכתיתתשובות, ובכל זאת הם מופיעים גם לתרום לפיתוח וההתמדה של אוטואימוניות והסרטן 14-17. הפרוטוקול המתואר במסמך זה יאפשר למנגנוני התפתחות ויסות PP pDCs כדי להיחקר באופן מלא יותר. בנוסף, גישה זו עשויה לאפשר מחקרים כדי להעריך את תפקוד PP PDC, וניתן להארכה להבנת הוויסות והתפקוד של אוכלוסיות אחרות של מערכת חיסון בתוך PPS.
Protocol
Representative Results
Discussion
טכניקת העברת המאמצת המתוארת כאן העריכה תרומת CDPs באוכלוסיית PP PDC עכברים נמען כי חסרים PP pDCs (למשל Ifnar – / – עכברים). בניסויים עתידיים, זה יהיה חשוב להעריך את הפוטנציאל של תת אב אחר ביצירת pDCs PP, בפרט אם pDCs PP נובע מFLT3 + CLPs. על שאלה זו הינה משמעותית שכן עדיין לא בר…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים בני הזוג. אלכס גלברד וילם Overwijk עצה על העברת גנים הידרודינמית. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מNIH (AI098099, מע), במרכז אנדרסון לסרטן אפיגנטיקה, מרכז MD Anderson לדלקות וסרטן (מע), וקרן RE בוב סמית החינוך (HSL).
Materials
| C57BL/6J | JAX | 664 | |
| B6.SJL | JAX | 2014 | |
| RPMI | Invitrogen | 11875-093 | |
| 15 ml conical tubes | BD Biosciences | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| RBC lysing buffer | Sigma | R7757 | |
| FACS buffer | PBS, 2 mM EDTA, 1% FCS, filter sterilized | ||
| Percoll | GE Healthcare | 17089102 | |
| 10XHBSS | Sigma | H4641 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Goat ant-rat IgG microbeads | Milteyni Biotec | 130-048-501 | |
| LD column | Milteyni Biotec | 130-042-901 | |
| Rat anti-D3 | BD Biosciences | 555273 | |
| Rat anti-CD19 | BD Biosciences | 553783 | |
| Rat anti-CD11b | BD Biosciences | 553308 | |
| Rat anti-CD11c | BD Biosciences | 553799 | |
| Rat anti-Ter119 | BD Biosciences | 553671 | |
| Anti-CD3 (PerCP) | eBiosciences | 45-0031 | |
| Anti-CD19 (PerCP) | eBiosciences | 45-0193 | |
| Anti-CD11b (PerCP) | eBiosciences | 45-0112 | |
| Anti-CD11c (PerCP) | eBiosciences | 45-0114 | |
| Anti-F4/80 (PerCP) | eBiosciences | 45-4801 | |
| Anti-Ter119 (PerCP) | eBiosciences | 45-5921 | |
| Anti-Sca-1 (PE.Cy7) | eBiosciences | 25-5981 | |
| Anti-CD115 (APC) | eBiosciences | 17-1152 | |
| Anti-c-kit (APC.Cy7) | eBiosciences | 47-1171 | |
| Anti-IL-7R (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-1271 | |
| Anti-Flt3 (PE) | eBiosciences | 12-1351 | |
| Anti-CD45.1 (APC.Cy7) | BD Biosciences | 560579 | |
| Anti-CD45.2 (PE.Cy7) | Biolegend | 109830 | |
| Anti-CD11c (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-0114 | |
| Anti-B220 (APC) | eBiosciences | 25-0452 | |
| Anti-Siglec-H (PE) | eBiosciences | 12-0333 | |
| Anti-PDCA-1 (FITC) | eBiosciences | Nov-72 | |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD Fortessa | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 27½ G needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
References
- Cella, M., et al. Plasmacytoid monocytes migrate to inflamed lymph nodes and produce large amounts of type I interferon. Nat. Med. 5 (8), 919-923 .
- Siegal, F. P., et al. The nature of the principal type 1 interferon-producing cells in human blood. Science. 284 (5421), 1835-1837 .
- Asselin-Paturel, C., et al. Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology. Nat. Immunol. 2 (12), 1144-1150 .
- Contractor, N., Louten, J., Kim, L., Biron, C. A., Kelsall, B. L. Cutting edge: Peyer’s patch plasmacytoid dendritic cells (pDCs) produce low levels of type I interferons: possible role for IL-10, TGFbeta, and prostaglandin E2 in conditioning a unique mucosal pDC phenotype. J. Immunol. 179 (5), 2690-2694 (2007).
- Li, H. S., et al. Cell-intrinsic role for IFN-alpha-STAT1 signals in regulating murine Peyer patch plasmacytoid dendritic cells and conditioning an inflammatory response. Blood. 118 (14), 3879-3889 (2011).
- D’Amico, A., Wu, L. The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3. J. Exp. Med. 198 (2), 293-303 .
- Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311 (5757), 83-87 .
- Liu, K., et al. In vivo analysis of dendritic cell development and homeostasis. Science. 324 (5925), 392-397 (2009).
- Naik, S. H., et al. Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo. 8 (11), 1217-1226 .
- Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nat. Immunol. 8 (11), 1207-1216 (2007).
- Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells. Blood. 121 (1), 11-19 .
- Hirai, H., et al. C/EBPbeta is required for ’emergency’ granulopoiesis. Nat. Immunol. 7 (7), 732-739 (2006).
- Overwijk, W. W., et al. Immunological and antitumor effects of IL-23 as a cancer vaccine adjuvant. J. Immunol. 176 (9), 5213-5222 (2006).
- Cervantes-Barragan, L., et al. Plasmacytoid dendritic cells control T-cell response to chronic viral infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (8), 3012-3017 (2012).
- Goubier, A., et al. Plasmacytoid dendritic cells mediate oral tolerance. Immunity. 29 (3), 464-475 (2008).
- Lande, R., et al. Neutrophils activate plasmacytoid dendritic cells by releasing self-DNA-peptide complexes in systemic lupus erythematosus. Sci. Transl. Med. 3 (73), .
- Liu, C., et al. Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice. J. Clin. Invest. 118 (3), 1165-1175 (2008).
- Fagarasan, S., Honjo, T. Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences. Nat. Rev. Immunol. 3 (1), 63-72 (2003).
- Cisse, B., et al. Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development. Cell. 135 (1), 37-48 (2008).
- Blasius, A. L., et al. Bone marrow stromal cell antigen 2 is a specific marker of type I IFN-producing cells in the naive mouse, but a promiscuous cell surface antigen following IFN stimulation. J. Immunol. 177 (5), 3260-3265 (2006).
- Symons, A., Budelsky, A. L., Towne, J. E. Are Th17 cells in the gut pathogenic or protective. Mucosal. Immunol. 5 (1), 4-6 (2012).
