إنتاج الحمض النووي الريبي لتحليل النسخ من الماوس النخاع الشوكي خلية الخلايا العصبية الحركية الهيئات بواسطة الليزر التقاط الالتصاع الدقيق
Summary
وقد تم إعداد عالية الجودة مجموع الحمض النووي الريبي من أجسام الخلايا من الخلايا العصبية الحركية الحبل الشوكي الماوس عن طريق الليزر التقاط microdissection بعد تلطيخ أقسام الحبل الشوكي مع أزور B في الإيثانول 70٪. يتم استرداد ما يكفي من الحمض النووي الريبي (~ 40-60 نانوغرام) من الخلايا العصبية الحركية 3000-4000 للسماح تحليل الحمض النووي الريبي المصب من قبل RNA-seq وqRT-PCR.
Abstract
يعد إعداد الحمض النووي الريبي عالي الجودة من الخلايا ذات الأهمية أمرا حاسما للتحليل الدقيق والهادف للاختلافات النسخية بين أنواع الخلايا أو بين نفس نوع الخلية في الصحة والمرض أو بعد العلاجات الدوائية. في الحبل الشوكي ، وهذا الإعداد من الخلايا العصبية الحركية ، والهدف من الاهتمام في العديد من الأمراض العصبية والعصبية ، ومما يعقد من حقيقة أن الخلايا العصبية الحركية تمثل <10 ٪ من مجموع سكان الخلية. تم تطوير الالتصاط الدقيق لالتقاط الليزر (LMD) لمعالجة هذه المشكلة. هنا، ونحن نصف بروتوكول لاسترداد بسرعة، وتجميد، وقسم الحبل الشوكي الماوس لتجنب تلف الحمض النووي الريبي عن طريق RNases الذاتية والخارجية، تليها تلطيخ مع أزور B في الإيثانول 70٪ لتحديد الخلايا العصبية الحركية مع الحفاظ على RNase الذاتية تثبيط. ثم يتم استخدام LMD لالتقاط الخلايا العصبية الملطخة مباشرة في العازلة تحلل ثيوسيانات جوانيدين، والحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي. وتستخدم التقنيات القياسية لاستعادة الحمض النووي الريبي الكلي وقياس سلامته. ويمكن بعد ذلك استخدام هذه المواد لتحليل المصب من النصوص من قبل RNA-seq وqRT-PCR.
Introduction
في أنسجة الثدييات المكونة من أنواع خلايا مختلفة متعددة ، أتاح ظهور أجهزة الالتقاط الدقيق لالتقاط الليزر (LMD) إمكانية اختيار نوع معين من الخلايا للتحليل على مستوى الحمض النووي الريبي أو البروتين. وفي الوقت الحاضر، تتيح تقنيات التضخيم والتسلسل من الجيل التالي استخدام مجموعة من إجمالي الحمض النووي الريبي من بضعة آلاف من الخلايا للحصول على جرد شامل نسبيا للنسخة، بما في ذلك تقييم المستويات النسبية للرنانات المضادة للريبي وتحديد مختلف الأشكال المقسمة. وحتى الآن، فإن تحليلات البروتيوميات لبضعة آلاف من الخلايا سوف تصل إلى أسفل من خلال الأنواع الأكثر وفرة فقط. على سبيل المثال، حددنا 1000 < من البروتينات الأكثر وفرة من 3000-4000 جسم خلايا الخلايا العصبية الحركية (غير مبين)، وقد أبلغ تشو وزملاء العمل مؤخرا تحديد 2665 البروتينات من ~ 15،000 الخلايا السرطانية1. ومع ذلك، ومع استمرار التطورات في قياس الطيف الكتلي، من المرجح أن تمتد هذه التحليلات إلى عمق أكبر بكثير.
هنا، نقدم بروتوكول محدد يستخدم لLMD من أجسام خلايا الخلايا العصبية الحركية من الحبل الشوكي للفئران، تليها إعداد الحمض النووي الريبي. وقد استخدم هذا البروتوكول في سياق مقارنة الحمض النووي الريبي من الخلايا العصبية الحركية من أول أكسيد فائق المتحولة وراثيا presymptomatic dismutase (SOD)1 التصلب الجانبي الضموري (ALS) الفئران مع الحمض النووي الريبي أعدت من سلالة SOD1 المعدلة وراثيا من نوع البرية من قبل كل من الحمض النووي الريبي-seq وqRT-PCR التحقق من صحة2. وتجدر الإشارة إلى أن الخلايا العصبية الحركية ، في القرن الأمامي للمادة الرمادية في الحبل الشوكي ، تشكل <10٪ من إجمالي عدد الخلايا ، وتحيط بها بحر من الخلايا الفلكية ، وعلى هذا النحو ، لا يمكن تفكيك ملفها الشخصي النسخي بسهولة من دراسات الحبل بأكمله. وبالتالي فإن نهج التقاط الليزر مثالي لتحليل تعبير الحمض النووي الريبي في هذه الخلايا ، مع الحفاظ على علم وظائف الأعضاء عن طريق استئصال وتجميد الحبل بسرعة بعد التغلغل الملحي القصير داخل القلب. سوماتا الخلايا العصبية الحركية هي كبيرة وبالتالي يمكن الكشف عنها بسهولة, هنا باستخدام صبغة لديها تقارب قوي للخلايا العصبية3. وبالإضافة إلى ذلك، مع هذا الحجم، توفر هذه الخلايا كمية كبيرة نسبيا من الحمض النووي الريبي لكل خلية تم التقاطها. الإجراء المستخدم، كما هو مفصل أدناه، يمكن تعديلها بسهولة للحصول على أنواع الخلايا العصبية الأخرى، فضلا عن أنواع الخلايا الأخرى المحتملة، التي تم تحديدها على وجه التحديد إما عن طريق تقنيات صبغ تلطيخ أو عن طريق تلطيخ الأجسام المضادة.
Protocol
Representative Results
Discussion
أهم مقياس لنجاح هذا البروتوكول لإنتاج الحمض النووي الريبي الإجمالي عن طريق التشريح الدقيق بالليزر لشرائح الحبل الشوكي هو قيمة RIN5. بالنسبة لعينات الحمض النووي الريبي من النوى الأعلى، فإن القيم التي تزيد عن 8.5 تنتج بانتظام تسلسلا عالي الجودة وبيانات qRT-PCR. إذا كان العائد منخفضا ولكن الجودة عالية ، كرر التحضير. إذا كانت السلامة أقل (حتى 7.5-8) ، فمن الأفضل العثور على مصدر المشكلة والمحاولة مرة أخرى. هناك العديد من الخطوات التي يمكن أن يحدث فيها شيء خاطئ ، ولكن في الحقيقة مصدرين فقط للمشكلة – تلوث RNase الداخلي أو تلوث RNase الخارجي. يمكن معالجة الأول عن طريق الممارسة ، بحيث يتم تقليل الوقت من تضحية الماوس إلى تجميد الحبل المدمج O.C.T. النقطة الأخرى في البروتوكول حيث RNase الذاتية يمكن أن تسهم في نتيجة سيئة أثناء إعداد شرائح. يجب أن تلتزم كل شريحة بشريحة PEN لدرجة حرارة الغرفة بسرعة ، ولكنها ستذوب (O.C.T تصبح واضحة). أسرع شريحة يمكن إعادة تجميد كلما كان ذلك أفضل. يحتوي نظام التبريد الذي نستخدمه على أسطح مسطحة داخل الغرفة عند -20 درجة مئوية ، والتي نستخدمها لإعادة تجميد الشريحة بسرعة. العثور على بقعة مماثلة في cryostat المستخدمة وتأكد من شريحة يصبح مبهمة مرة أخرى بسرعة.
تعقب مصادر RNase الخارجية يمكن أن يكون صعبا، لأن هناك الكثير من الاحتمالات. الكواشف الوحيدة المستخدمة التي ليست خالية صراحة RNase هي O.C.T. وB Azure. إذا كان أداء Azure B مرضيا من قبل، فجرب زجاجة جديدة من O.C.T. على الرغم من أن هذا الكاشف لم يكن مشكلة أبدا. كما يمكن استبدال الكواشف الخالية من RNase، حتى من مورد مختلف. مصدر أكثر احتمالا هو المحقق. بالإضافة إلى تنظيف شامل لمنطقة العمل، فإنه غالبا ما يكون من المفيد أن يكون عضو مختبر آخر متابعة على طول ومراقبة جميع الخطوات في الإجراء. حتى لو كان هذا هو الشخص الذي لا يؤدي هذا الإجراء بشكل روتيني، مجموعة جديدة من العيون قد تلتقط مصدر التلوث دون أن يلاحظها أحد.
إن توسيع نطاق هذا البروتوكول ليشمل استعادة الحمض النووي الريبي من خلايا الحبل الشوكي الأخرى، أو من خلايا الحبل الشوكي من أنواع أخرى، أو من أنواع خلايا محددة في أعضاء أخرى سيتطلب تعديلات في عدة مجالات تهدف إلى تحقيق تحديد واضح للخلايا ذات الأهمية مع تجنب، أو على الأقل التقليل من تأثير RNase الذاتية. في البروتوكول هنا ، سمحت الإزالة السريعة وتجميد الحبل ، إلى جانب تلطيخ Azure B في الإيثانول بنسبة 70٪ ، بالتقليل من تدهور الحمض النووي الريبي وسهولة تحديد أجسام خلايا الخلايا العصبية الحركية. أزور B هو وصمة عار الهسوتشيماكيميائية راسخة للخلايا العصبية التي يبدو أن ربط الحمض النووي الريبي3 وقد استخدمت لتقييم محتوى الحمض النووي الريبي من الخلايا العصبية في عينات تشريح أنسجة الدماغ من المرضى الذين يعانون من مرض تنكسي عصبي6. وتجدر الإشارة إلى أن تلطيخ Azure B لم يؤثر على سلامة الحمض النووي الريبي المنقى أو قدرته على أن يتم نسخه وتحليله عكسيا. وقد استخدمت الأصباغ الأخرى، مثل كريسيل البنفسجي7 والأزرق تولويدين8 في بروتوكولات LMD مماثلة. جمع جثث الخلية مباشرة في محلول ثيوسيانات guanidine كما تم تشريحها قدمت الخطوة الأخيرة التي أسفرت عن الانتعاش الروتيني للجيش الملكي النيبالي سليمة.
ويمكن تصور نهج مماثلة للخلايا والأعضاء الأخرى، مع الاعتراف بأن تحديد الخلايا ذات الأهمية مع التقليل إلى أدنى حد ممكن، أو، ويفضل، منع تدهور الحمض النووي الريبي عن طريق RNases الذاتية هو الشرط الحاسم للتحليل الناجح. في الأنسجة التي لديها مستويات عالية من RNase، مثل البنكرياس، وقد تم الجمع بين التعامل السريع وانخفاض درجة الحرارة للسماح باستعادة الحمض النووي الريبي من β الخلايا، والاستفادة من autofluorescence الطبيعية للتصور9. كما تم الإبلاغ عن الإجراءات التي تستخدم تلطيخ الأجسام المضادة لتحديدالهوية 10، ولكن لم تكن ناجحة تماما في أيدينا. وأخيرا، تتوفر العديد من نماذج الماوس التي تعبر عن بروتينات الانصهار الفلورية(أي GFP، YFP، RFP) في الخلايا ذات الاهتمام، والتي يمكن استخدامها لتحديدها في أقسام الأنسجة على المجهر LMD. في الواقع، سلالات الماوس قمنا بتحليل مع هذا البروتوكول التعبير عن بروتين الانصهار بين SOD1 و YFP11،والخلايا العصبية الحركية الحبل الشوكي هي الفلورسنت للغاية. لم نتمكن، مع ذلك، من العثور على مجموعة من يغسل الإيثانول و / أو ظروف الجفاف التي من شأنها أن تزيل في وقت واحد O.C.T.، وتمنع نشاط RNase، والحفاظ باستمرار على ما يكفي من فلورية YFP للسماح تصور الخلايا العصبية الحركية وشفائها من قبل LMD. ربما يمكن العثور على بروتين فلوري جديد أو متغير من تلك المتاحة التي تحافظ على الفلورسينس في المذيبات العضوية للتغلب على هذا القيد.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون أن يشكروا جورج فار وأعضاء مختبر هورويتش على المناقشات المفيدة. وقد دعم هذا العمل معهد هوارد هيوز الطبي.
Materials
| Ketamine | Webster Veterinary | 26637041101 | Any source approved by the institutional veterinary service |
| Dissection tools (scissors, forceps, etc.) | Any convenient source of high-quality dissection instruments | ||
| Cryostat | Leica Microsystem | CM3050S | Other cryostats should be suitable |
| LMD6000 B | Leica Microsystem | Other LMD systems have not been tested | |
| RNase-free PEN-membrane 2 μm slides | Leica Microsystem | 11505189 | Other slide types have been tested and do not perform well |
| RNeasy Micro kit (50) | Qiagen | 74004 | Any kit that uses guanidine thiocyanate lysis buffer and has been tested for recovering small quantities of RNA can be used |
| Agilent 2100 BioAnalyzer | Agilent Technologies | G2939A | |
| Azure B Certified | MP Biomedicals | 190520 | Critical! Product from any source has to be tested before use for its ability to maintain RNA integrity |
| PBS | Sigma Life Science | D8537 | Any reliable source of RNase-free PBS |
| RNA Ethanol 70% (made with DEPC treated water) | American Bioanalytical | AB04010-00500 | Any reliable source, can be lab-made |
| Water, RNase-free, Endotoxin tested (treated with DEPC to eliminate RNase) | American Bioanalytical | AB02128-00500 | Any reliable source, can be lab-made |
| RNase AWAY | Invitrogen Life Technologies | 10328-011 | Other similar RNase removal reagents, such as RNaseZAP (also from Invitrogen) can be used |
| 2-Methylbutane | Electron Microscopy Sciences | 78-78-4 | Any source |
| Maxymum Recovery microfuge tubes (0.6 and 1.5 ml) and pipette tips | Axygen | 311-03-051 & 311-09-051 | Ultra-low retention, RNase free tubes and tips; test other manufacturer's products before using |
| O.C.T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryomold Intermediate Size | Tissue-Tek | 4566 | |
| Lab wipes (Kimwipes) | KIMTECH | 34155 |
References
- Zhu, J., Nie, S., Wu, J., Lubman, D. M. Target proteomic profiling of frozen pancreatic CD24+ adenocarcinoma tissues by immuno-laser capture microdissection and nano-LC-MS/MS. J. Proteome. Res. , (2013).
- Bandyopadhyay, U., et al. RNA-Seq profiling of spinal cord motor neurons from a presymptomatic SOD1 ALS mouse.. PLoS ONE. 8 (1), 10-1371 (2013).
- Shea, J. R. A method for in situ cytophotometric estimation of absolute amount of ribonucleic acid using azure B1. J. Histochem. Cytochem. 18 (2), 143-152 (1970).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin. Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol. Biol. 7, (2006).
- Doebler, J. A., Rhoads, R. E., Anthony, A. Neuronal RNA in Pick’s and Alzheimer’s diseases. Comparison of disease-susceptible and disease-resistant cortical areas. Arch. Neurol. 46 (2), 134-137 (1989).
- Lobsiger, C. S., Boillée, S., Cleveland, D. W. Toxicity from different SOD1 mutants dysregulates the complement system and the neuronal regenerative response in ALS motor neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (18), (2007).
- Ferraiuolo, L., et al. Microarray analysis of the cellular pathways involved in the adaptation to and progression of motor neuron injury in the SOD1 G93A mouse model of familial ALS. J. Neurosci. 27 (34), 9201-9219 (2007).
- Sturm, D., et al. Improved protocol for laser microdissection of human pancreatic islets from surgical specimens. J. Vis. Exp. 6 (71), (2013).
- Burbach, G. J., Dehn, D., Nagel, B., Del Turco, D., Deller, T. Laser microdissection of immunolabeled astrocytes allows quantification of astrocytic gene expression. J. Neurosci. Methods. 138 (1-2), 141-148 (2004).
- Wang, J., et al. Progressive aggregation despite chaperone associations of a mutant SOD1-YFP in transgenic mice that develop ALS. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (5), 1392-1397 (2009).
