En rask og modulær protokoll for generering av rekombinante vaccinia-virus som uttrykker fluorescerende merkede proteiner samtidig ved hjelp av metoden for forbigående dominerende utvalg er beskrevet her.
Merking av virusproteiner med fluorescerende proteiner har vist seg å være en uunnværlig tilnærming for å fremme vår forståelse av virus-vert interaksjoner. Vaccinia virus (VACV), den levende vaksinen som brukes i utryddelse av kopper, er spesielt egnet til fluorescerende levende cellemikroskopi på grunn av sin store virionstørrelse og hvor enkelt den kan konstrueres på genomnivå. Vi rapporterer her en optimalisert protokoll for å generere rekombinante virus. De minimale kravene til målrettet homolog rekombinasjon under vaccinia-replikering ble bestemt, noe som gjør det mulig å forenkling av konstruksjonsgenerering. Dette gjorde det mulig for alliansen av forbigående dominerende utvalg (TDS) med en fluorescerende reporter og metabolsk utvalg for å gi en rask og modulær tilnærming til fluorescerende merker virale proteiner. Ved å effektivisere genereringen av fluorescerende rekombinante virus, er vi i stand til å legge til rette for nedstrøms applikasjoner som avansert bildeanalyse av mange aspekter av virus-vert-samspillet som oppstår under virusreplikering.
Vaccinia virus (VACV) er prototypisk poxvirus og svært relatert til variolavirus, årsaken til kopper. Begge disse virusene er medlemmer av ortopedi slekten som inkluderer andre bemerkelsesverdige patogener som monkeypox og ectromelia virus (mousepox)1. Ortopedivirus har store dobbeltstrengede DNA-genomer (180-220 kb) som koder oppover på 200 anslåtte åpne leserammer2,3. Replikering av disse virusene innebærer dannelse av en perinuclear virusfabrikk, hvor modne virus (MV) er laget, og trans-Golgi-nettverket der en undergruppe av MV kjøper to ekstra membraner for å generere innpakkede virus (WV) (gjennomgått av Roberts og Smith4). Ortopedoksgenomer er svært mottagelige for genetisk manipulasjon på grunn av den høye graden av genetisk rekombinasjon som er en funksjon av VACV genomreplikasjon og formidles av viral DNA-polymerase5. Generering av rekombinante virus er avhengig av homolog rekombinasjon og lineære DNA-molekyler med homologier så små som 12 bp er tilstrekkelig til å megle rekombinasjon i forgjeves virusinfiserte celler6. Fluorescerende merking av vacciniavirus kan gi ekstremt lyse viruspartikler på grunn av den store størrelsen på ortopedokspartikler, noe som gjør det mulig å inkorporere mange fluorescerende proteiner per virion7. Vaccinia har kapasitet til å bære store fragmenter av utenlandsk DNA8, og dessuten kan mangelen på stiv kapsidsymmetri tillate en viss fleksibilitet når man uttrykker virale proteingenfusjoner fra deres endogene loci9. Fluorescerende merking av VACV-proteiner har vist seg uvurderlig for studiet av vertspatogeninteraksjoner på subcellulært nivå, spesielt innen virusinngang10, transport11-13, og morfogenese, spesielt av innpakkede virioner7.
Rekombinante virus kan velges ved redning av en svekket vekst fenotype14,15, metabolsk utvalg16-18, eller ved uttrykk for et markørgen (f.eks X-gal 19 eller fluorescerende protein13,20). Her beskriver vi utvalget av fluorescerende virus ved hjelp av en kraftig kombinasjon av fluorescerende og metabolsk utvalg. Forbigående dominerende utvalgsvektorer (TDS), utviklet av Faulkner og Moss (1990)21, gjør det mulig å integrere markører sammen med ønsket fluorescerende merket gen av interesse. Når metabolsk seleksjon fjernes, kan det oppstå en sekundær rekombinasjonshendelse som utskiller seleksjonsgenene, men etterlater det fluorescerende taggede virusproteinet intakt. Figur 2 nedenfor gir en oversikt over den eksperimentelle prosedyren. Seleksjonsgenene som brukes i denne studien er mCherry og Escherichia coli guanine fosphoribosyltransferase (gpt) gen, begge uttrykt fra en syntetisk tidlig / sen viral promotor og brukt tidligere av Cordeiro et al. 22 I tillegg er det fluorescens av det taggede fusjonsproteinet av interesse. Når metabolsk seleksjon fjernes, utskilles de valgbare markørene (mCherry og gpt), slik at bare fluorescensen til det taggede genet, som tillater identifisering av de riktige rekombinante virusene. Eksisjonen av utvalgsmarkørene gir muligheten til å kombinere flere fluorescerende koder, slik at vi kan lage virus med evnen til å fluorescerende merke flere virusproteiner samtidig. Tidligere studier har bestemt de minimale homologikravene for vaccinia rekombinasjon av lineære og sirkulære DNA-molekyler transfektet til vaccinia virusinfiserte celler6. Vi ønsket å bestemme rekombinasjonseffektiviteten av varierende homologilengder av flankearmer i gpt-mCherry TDS-vektoren gjennom innlemmelsen i det vaccinia virale genomet. Det ble fastslått at homologe regioner på 100 bp i TDS-vektoren er tilstrekkelig til å målrette og formidle innsetting av rekombinant DNA i VACV-genomet ved homolog rekombinasjon (figur 4). Mens mindre homologilengder også ville muliggjøre rekombinasjon, ga 100 bp homologilengder nok rekombinante virus som lett kunne identifiseres med metabolsk og fluorescerende utvalg. DNA-fragmenter av denne størrelsen kan syntetiseres kommersielt til relativt lave kostnader og letter i stor grad produksjonen av flere vektorer for opprettelse av rekombinante virus. Vi valgte å øke homologilengden til 150 bp for å gi større rekombinasjonsfrekvens samtidig som vi holdt ned kostnadene ved syntese av oligonukleotidsekvensen av flankeregioner.
Denne teknikken beskriver en effektiv og modulær protokoll for opprettelse av rekombinante virus som uttrykker fluorescerende merkede virusproteiner. Metoden sikrer at den eneste endringen i viralgenom er tillegg av en tag eller markør, og etterlater ingen valgmarkører. Den korte armlengden som kreves for homolog rekombinasjon muliggjør sin direkte syntese, eliminerer flere tidkrevende runder med PCR og kloning, mens fluorescensen av mCherry og metabolsk GPT-utvalg brukes til å isolere virale rekombinasjonsintermenn. Disse mellomprodukter kan løses, etter fjerning av utvalg, til et virus med et merket gen eller tilbake til foreldretypen. En lignende metode som involverer bruk av både fluorescerende og metabolsk seleksjon har blitt beskrevet tidligere27, selv om metoden som brukes i denne studien bruker kortere, syntetiserte områder av homologi, slik at identifisering av ønsket rekombinant virus ved å forestille seg fluorescensen til det taggede genet av interesse. Dette sekundære utvalget gjelder bare for merking av svært uttrykte virusgener som produserer tilstrekkelig fluorescens i en plakkanalyse. Alternativt kan man se for seg innsetting av en komplett uttrykkskassett, for eksempel et fluorescerende protein under en sterk viral promotor. I dette tilfellet vil venstre og høyre armer definere innsettingspunktet i stedet for det virale genet som skal merkes.
Det er noen viktige trinn som viste seg å være nyttige under den eksperimentelle prosedyren. Væskeoverlegget i trinn 2.3.3 beskrevet ovenfor viste seg å være avgjørende for deteksjon og isolering av røde/grønne fluorescerende plakk. Vi tror at kombinasjonen av GPT-seleksjonsreagenser og agaroseoverlegg avskrekket veksten av rekombinante virus og derfor byttet til et flytende overlegg for det første trinnet med å forsterke virus etter transfeksjon. Det er også viktig å velge fluorescerende plakk som viser lokalisert tagfargefluorescens for berikelse og rensing, da mellomprodukter som følge av venstre arm rekombinasjon kan resultere i diffus fluorescens observert i plakk hvis venstre arm også inneholder en promotorsekvens. mCherry-markørgenet i TDS-vektoren kan også erstattes av gfp, for eksempel for å tillate enkel inkorporering og valg av mCherry som en fluorescerende tag.
Noen teknikker beskrevet ovenfor varierer litt fra etablerte metoder for å skape rekombinant vaccinia virus. For eksempel er MOI av virus som brukes til å lage rekombinanter normalt mindre enn 128, men bruken av høyere MOIer har vært tilstrekkelig for å skape rekombinant vaccinia-virus ved denne metoden. Bruken av GPT-seleksjonsreagenser krever normalt preinkubering av cellene med seleksjonsreagenser18, men å legge dem til i redningsfasen etter infeksjon ga fortsatt tilstrekkelig utvalg av ønskede rekombinanter, spesielt på grunn av tilstedeværelsen av en fluorescerende seleksjonsmarkør også.
Som nevnt tidligere er en av begrensningene i denne teknikken at det sekundære fluorescensvalgtrinnet er avhengig av at det taggede proteinet av interesse blir sterkt uttrykt, på et nivå som muliggjør deteksjon for øye i en plakkanalyse. Uten dette ville det være mulig å rense virus som bare viste mCherry fluorescens, hvorav minst 50% ville inneholde de ønskede rekombinante virusene, som kunne identifiseres ved molekylære strategier som PCR beskrevet i trinn 2.12 ovenfor. En annen begrensning kan være inaktivering av visse proteiner som følge av merkingen. Den fluorescerende taggen kan gjennomgå mutasjoner eller bli utskilt av det rekombinante viruset med passivring over tid. Derfor anbefales regelmessig prøvetaking av rekombinante viruslagre ved mikroskopi og PCR. Til slutt kan det være en grense for antall fluorescerende merkede proteiner som kan innlemmes i et enkelt virus. Et aspekt av dette er evnen til å visualisere dem alle samtidig; gitt den overlappende karakteren av utslippsspektra av tilgjengelige fluorescerende koder, er det viktig å velge dem nøye for å sikre minimal spektral blødning. I tillegg åpner bruk av nært beslektede koder som GFP og Cerulean muligheten for rekombinasjon mellom de to, avhengig av deres plasseringer i det rekombinante genomet.
Den modulære karakteren av denne teknikken muliggjør enkel utskifting av fluorescerende koder basert på kompatibilitet med andre fargestoffer og / eller taggvalg. Ved å utskille valgbare markører tillater TDS-metoden seriell tilsetning av ulike fluorescerende proteiner eller kombinasjonen av TDS-basert merking med TDS-baserte genslettinger for fenotypiske analyser29. Som et eksempel på nytten av denne tilnærmingen ble det generert et dobbeltmerket fluorescerende virus som merker viruskjerner og WV-membranen. Imaging studier med dette viruset kan brukes til å studere bevegelse, morfogenese og innpakning av virus under virusreplikasjon. Ennå ukarakteriserte vaccinia virale proteiner kan også bli merket og studert av denne teknikken.
Vaccinia virus har blitt mye brukt i avbildningsstudier på grunn av mange egenskaper av viruset som er gunstige for levende cellemikroskopi. Fluorescerende koder uttrykkes fra det virale genomet, og eliminerer behovet for transfeksjon, slik at primære celler avledet fra infiserte dyr eller ikke-overførbare celler enkelt kan analyseres. I utgangspunktet ble fluorescerende VACVer brukt til enkel subcellulær sporing av virusbevegelse30, men nyere tilnærminger har utvidet verktøyet til å omfatte FRET-studier31, FRAP ved enkeltviruspartikler32, promotorreportere33, intravital avbildning34og strukturelle studier35-37. Alle disse teknikkene kan være innenfor enklere og nærmere rekkevidde kombinert med denne metoden for å skape rekombinante fluorescerende virus.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av Australian Research Council Federation Discovery Project grant #1096623.
Mycophenolic acid | Sigma-Aldrich | M3536-50MG | Dissolve in 0.1N NaOH |
Xanthine | Sigma-Aldrich | X0626-5G | Dissolve in 0.1N NaoH |
FuGENE HD transfection reagent | Promega | E2311 | |
Fluorescence microscope fitted with Chroma filters 31001, 31002 | Olympus, Chroma | BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma) |