Minimal Invasive Gründung von murinen orthotopen Blasen Xenografts
Summary
Die etablierte Technik, um primäre invasive orthotopen Blasenkrebs Xenografts impfen erfordert Laparotomie und Mobilisierung der Blase. Dieses Verfahren verursacht eine signifikante Morbidität auf Mäuse, ist technisch anspruchsvoll und zeitaufwendig. Wir haben deshalb eine hohe Präzision, die perkutane Ansatz verwendet Ultraschallkontrolle.
Abstract
Orthotopen Blasenkrebs Xenografts sind der Goldstandard, um molekulare Zellmanipulationen und neue therapeutische Wirkstoffe in vivo zu untersuchen. Geeignete Zelllinien werden entweder durch intravesikale Instillation (Modell Nonmuscle invasives Wachstum) oder intra-Injektion in den Blasenwand (Modell von invasiven Wachstum) geimpft. Beide Verfahren sind sehr aufwendig und zeitraubend. Zusätzlich hat die Oberflächen-Modell seine Mängel aufgrund des Fehlens von Zelllinien, die nach Applikation tumorigenen sind. Intramurale Injektion, andererseits wird durch die Invasivität des Verfahrens und der damit verbundenen Morbidität für den Host-Maus getrübt.
Mit dieser Mängel im Auge modifizierten wir den bisherigen Methoden, um eine minimal-invasive Ansatz für die Erstellung von orthotopen Blasenkrebs Heterotransplantate zu entwickeln. Mit Ultraschall-Führung haben wir erfolgreich perkutanen Inokulation der Blasenkrebszelllinien UM-UC1, UM-UC3-und UM-geführtUC13 in 50 athymischer. Wir konnten zeigen, dass dieser Ansatz ist zeitsparend, präzise und sicher. Mit dieser Technik wird zunächst ein Raum unter der Blasenschleimhaut mit PBS erstellt, und die Tumorzellen werden dann in diesen Raum in einem zweiten Schritt eingespritzt. Das Tumorwachstum wird in regelmäßigen Abständen mit Biolumineszenz-Bildgebung und Ultraschall überwacht. Die durchschnittlichen Tumorvolumina stetig zugenommen in allen, aber in einem unserer 50 Mäuse im Verlauf der Studie.
In unserer Einrichtung, diese neuartige Ansatz, der Blasenkrebs Xenotransplantat Impfung in einem minimal-invasive, schnelle und sehr präzise Weise ermöglicht, hat das traditionelle Modell ersetzt.
Introduction
Die Krebsforschung ist abhängig von Tiermodellen für menschliche Krebszelllinien mit Hilfe von Patient Tumoren in Ordnung abgeleitet, um unser Verständnis der Tumorbiologie zu vertiefen. Für die in vivo Wachstumsanalyse unter verschiedenen Behandlungsstrategien murinen orthotopen Blasenkrebs Modelle bleiben der Referenzstandard 1,2. Die Impfung der menschlichen Blasenkrebszellen in immungeschwächten Mäusen (Xenograft-Modell) basiert auf intravesikale Instillation ("intravesical-Modell") 3,4,5 oder direkte Injektion in die Blasenwand ("intra-Modell") 6,7. Beide Verfahren können auch in Ratten 8,9 durchgeführt werden.
Intravesikale Instillation induziert die Bildung von Tumoren auf der Oberfläche Urothelzellen der Blase, die dann Gegenstand einer späteren intravesikale Instillation des erfindungsgemäßen Behandlungsmitteln. Jedoch ist die Anzahl von Zelllinien, die, wenn sie über diesem Verfahren geliefert zuverlässig tumorigenen beschränkt eind eine dieser Zellinien KU7, wurde kürzlich gezeigt, um HeLa 4,10 sein. Intravesikale Instillation ist auch zeitaufwendig aufgrund der notwendigen Verweilzeiten und induziert häufig Tumorwachstum in benachbarten Elementen der Harnwege, einschließlich der Harnröhre, Harnleiter und Nierenbecken 11. Darüber hinaus führt die intravesikale Instillation oft das Tumorwachstum auf dem Boden der Blase, wo die Harnleiter in die Blase, und dies kann der oberen Atembehinderung und die gleichzeitige Nierenversagen verursachen.
Primären invasiven Blasenkrebs-Xenotransplantaten, die sich für systemische Behandlungen werden durch direkte Injektion von Tumorzellen in die Blasenwand 12 geschaffen. Obwohl zahlreiche Zelllinien wachsen angemessen in diesem Modell ist die Beschränkung der Invasivität des Modells auf die Notwendigkeit für einen Bauchschnitt 13 zusammen. Das Modell ist auch eine Herausforderung, aufgrund der technischen Schwierigkeiten bei der Injektion von Zellen genau in die Muskelwand lernender Blase.
Ein neuer Ansatz zur orthotopen primären invasiven Blasenkrebs Xenografts bei Mäusen zu errichten, hat in unserer Abteilung, um die bestehenden Mängel der "intra-Modell" entwickelt, anzugehen. Wir waren in der Lage, die perkutane, Ultraschall-gesteuerte Injektion von Blasenkrebszellen in die vordere Blasenwand, was zu dieser neuen Technik zu optimieren, um die etablierte invasive Modell erfolgreich zu ersetzen. Außerdem haben wir möglicherweise verbessert die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der "intra-Modell".
Protocol
Representative Results
Discussion
Fast alle großen Fortschritte in der Krebstherapie werden die Tests in Tiermodellen benötigen vor Beginn der klinischen Studien. Tiermodellen für Krebs sind wesentliche Instrumente, die Forscher ermöglichen, Tumorbiologie in vivo zu untersuchen. Orthotopische Xenotransplantatmodellen bleibt der Goldstandard 1,2 und weiterhin die größte Flexibilität (hinsichtlich der Auswahl der Zelllinien) bieten und haben die meisten praktischen Nutzen.
Das dargestellte Verfahren ist ein minimal-invasives Änderung der orthotopen Modell zuvor von Dinney et al. Beschrieben 12 Wir haben festgestellt Xenotransplantattumoren durch Ultraschall gesteuerte perkutane Injektion von drei verschiedenen Zelllinien mit einer technischen Erfolgsrate von 100%. Während der kontinuierlichen Follow-up, 98% der Mäuse zeigten konstante Zunahme des Tumorvolumens.
Mit der Durchführung einer minimal-invasiven Technik konnten wir die bestehenden Grenzen der intra-Modell anzugehen. Neben respefesselndes Tierschutz, die reduzierte Invasivität des Verfahrens trägt zur Reproduzierbarkeit in vivo-Experimente durch Verringern der Anzahl von chirurgischen Komplikationen. Es ist höchst Zeit, um eine effektive Bauch Laparotomie und der damit verbundenen Notwendigkeit für den Wundverschluss zu vermeiden. Wir waren in der Lage, signifikant die Verfahrenszeit pro Tier 3,4 min (± 1,6) zu verringern. Allerdings ist der Hauptvorteil der neuartigen Ansatz deren Richtigkeit. Hochauflösendes Ultraschall ermöglicht es uns, den Raum unter der Schleimhaut der Blasenwand erstellt von Kochsalzinjektion visualisieren. Dieser erste Schritt ermöglicht Injektion der Tumorzellinjektion in einem zweiten Schritt und das Risiko von Tumorzell Verschütten minimiert. Dies steht im Gegensatz zu der Technik der intramuralen Injektion nach Laparotomie, wo es unmöglich ist, Nadelplatzierung visualisieren und es gibt immer eine gewisse Unsicherheit über die genaue Tiefe der Injektion. Auch, wie wir Impfen Tumorzellen streng in die vordere Blasenwand, Tumor growth an der Hinterwand der Blase vermieden wird. Anschließend wird die Geschwindigkeit der obstruktiven Komplikationen aufgrund von Tumorwachstum in der Nähe der Ureterenmündungen ist äußerst selten. Dieser Effekt ermöglicht Begleit mehr Wachstum und Behandlungszeiten.
Die wichtigste Einschränkung der Ultraschall-gesteuerte Tumorimpfung ist die Notwendigkeit für eine angemessene technische Ausrüstung. Daher ist die Leistung dieser Verfahren wird wahrscheinlich Zentren, die in Tiermodellen von Krebs beim Menschen spezialisiert sind, eingeschränkt werden. Dies sollte die Zusammenarbeit zwischen den Forschungsgruppen außerhalb dieser Institutionen und Gruppen mit Erfahrung in solchen neuen Tier-Modellierung zu fördern.
Obwohl abhängig von Vertrautheit mit der Ultraschall-Bildgebung und etwas Fingerfertigkeit, ist dieses Modell einfach unter kompetenter Anleitung zu lernen. Der entscheidende Schritt im Verfahren ist die Schaffung eines künstlichen Raum submukosal in der Blasenwand mit Kochsalzlösung. Sobald dieser Raum ohne Perforation o erstelltf der Schleimhautschicht, bleibt es für mehrere Minuten stabil. Die Führung des zweiten Nadel in diesen Raum, um die Tumorzellen zu impfen ist relativ einfach. Die Hauptkomplikation bei der Erstellung des submukösen Raum Perforation der Nadel in das Blasenlumen. Die Schaffung eines submukösen Raum bleibt jedoch möglich. Die Nadel langsam in die Blasenwand zurückgezogen werden, und die nur Kochsalzlösung injiziert, wenn die Schleimhautschicht über der Spitze der Nadel dreht. Nach diesem Manöver das submucosale Raum ist weniger stabil (Kochsalzlösung wird das Blasenlumen innerhalb 30-60 sec entweichen) und der Injektion der Tumorzellen zu schnell durchgeführt werden. Verschütten von Tumorzellen in das Blasenlumen kann in diesen Fällen mit Perforation der Schleimhaut auftreten. Obwohl der Verlust von Tumorzellen aus dem intra-Raum könnte zu einer verminderten Tumorvolumen während des Follow-up zu führen, haben wir nie beobachtet jede intravesikale Tumoraufnahme.
Ein weiterer potenzieller complication das Verschütten von Tumorzellen in die Bauchhöhle durch den Einspritzkanal. Wir beobachteten nur eine intraperitoneale Tumorzell Verbreitung in 50 Tieren, und dies geschah in einem unserer ersten Versuche. Wir führen dies auf die Injektion einer zu großen Tumorzellsuspensionsvolumen. Dies wurde durch die Tatsache, daß die Verringerung des Volumens von 50 bis 40 ul führte zu keiner weiteren intraperitoneale Auslaufen unterstützt.
Diese minimal-invasive Impfung von murinen orthotopen Blasenkrebs Xenotransplantat stellt eine innovative Änderung der bestehenden "intra-Modell", profitiert sowohl die Prüfer und die Tiere gleichermaßen. Die Vorteile dieses Modells fördern die Anpassung an andere Organe wie Nieren-, Prostata-und Leber um orthotope Xenograft-Tumoren in einem minimal-invasive Art und Weise herzustellen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich für die Durchführung Eliana Beraldi virale Transduktion von Tumorzelllinien und Ben Deeley für seine Anweisung zum Gebrauch des Kleintier-Ultraschall-Bildgebungsplattform bestätigen.
Dieses Projekt wurde von der Deutschen Stiftung-System unterstützt (DFG; JA 2117/1-1: 1), der kanadischen Krebsgesellschaft Forschungsinstitut und ein Mentored Physician Scientist Award von Vancouver Coastal Health Research Institute. Die Ultraschall-Bildgebungsplattform wurde von der kanadischen Stiftung für Innovation gefördert.
Materials
| Chlorhexidine gluconate (2%) | Aplicare | 82-319 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Thermo Scientific | SH3008101 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | SH3007103 | |
| Matrigel | BD Bioscience | 356234 | Keep between 2-4⁰C |
| Isoflurane | Baxter Corporation | 402-069-02 | |
| Trypsin (0.25%) | Thermo Scientific | SH3004202 | |
| Syringe (1ml) | BD Bioscience | 309659 | |
| Hypodermic needle (30G; ¾ inch) | Kendall | 830340 | |
| Angiocatheter (24G) | BD Bioscience | 381112 | |
| Vevo 770 small animal imaging platform | VisualSonics | ||
| RMV 706 ultrasound scanhead | VisualSonics | ||
| IVIS Lumina III | Caliper Life Science |
References
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