植物蛋白复合体的翻译后修饰的鉴定

注：所有的步骤都在室温下进行，除非另有说明。 1。植物材料和缓冲器的制备 对于N。本生 生长的根癌土壤杆菌的菌株息进行瞬时表达（在此示例PRF-FLAG，PRF-3xHA，PTO-FLAG和空载体作为对照）通过在28在液体培养基（含有适当抗生素的L培养基）摇动（200rpm）下°C，直到固定相。 收集和沉淀农杆菌通过离心（3,000×g离心5分钟）。弃上清，重悬制粒农杆菌中渗透的缓冲。 通过获得的光密度（OD）值在600nm的吸光率（Abs 600纳米）测量土壤杆菌的量。调整细菌的OD到0.1-0.8。 渗透4周老N。植物本生 （22℃，16小时光照）与农杆菌由汉D（用1毫升无针头的注射器），或通过真空（加0.02％体积/体积表面活性剂）。 注意：使用第一近乎完全展开的叶片，两个紧接在老叶为最有效​​的蛋白表达。对于检测泛素化或乙酰化蛋白的渗透叶子用100nM的MG-132或100毫微克/毫升曲古抑菌素A，分别在1和2天后浸润。 收获叶浸润2-5天后渗透和冷冻在液氮中。存储样本中的-80℃冰箱。 注：事先通过计算样本超过5天的时间过程，并通过免疫印迹法检测蛋白水平确定相关蛋白表达的最好水平。 对于A。稳定拟南芥转基因株系 A.成长拟南芥种子在6孔板中补充用5ml MS液体培养基（1％w / v的蔗糖）中，每孔。放三到转基因一行五种子（消毒和分层）利息或每孔未转化的对照线。摇以200rpm板转移到生长室的前两天，离开2周（22℃，10小时光照）。 收获样品并冷冻在液氮中。 注意：您可以作为控制用的表达无关蛋白具有相同标签的目的蛋白的转基因系。 缓冲器 准备缓冲A.德气体缓冲1-2小时（对于类受体蛋白激酶，其他膜结合蛋白和核蛋白，加1％V / V IGEPAL CA-630 53）。 注意：你可以保持缓冲液A在4℃下去。你可以用1％V / V的Triton代替IGEPAL CA-360。 提取准备前加入80ml冷的缓冲液B至少1-2小时。 注意：组织与提取缓冲液的理想的比例为1:4（重量/体积）。 2。蛋白抽提之前，为了提取准备加入80ml冷的缓冲液C。 <b转/>注：添加10μMMG-132对泛素化蛋白的检测。 磨20克N的本塞姆氏组织（约15叶）或A。用研钵和研杵拟南芥幼苗（每6孔板2-4克）在液氮中。 加上80毫升冷的缓冲液C，以各20 g地组织，拌匀，和解冻的冰。 注：研所有样品的同时（利息及控制蛋白质）。 均质与3连发每个10秒的全速组织匀浆器（预冷4℃）。通过在4 22-25微米的组织和离心机以30,000×g离心30分钟过滤 °C。 注：此外，同质化的新鲜预冷的研钵和杵。 对于阻塞和洗涤步骤的亲和基质，配制20 ml缓冲液D的用500ml冷缓冲液D中含1％BSA为5分钟，在4块100毫升合适的亲和基质 °C。 注意：首选AF菲妮迪矩阵包括抗FLAG M2琼脂糖，链亲和素琼脂糖，GFP-Trap_A和抗HA琼脂糖。 洗3次用1毫升冷缓冲液D。 通过0.45μm的注射器过滤器除去叶提取物和过滤器的上清液放入冰上的一个新的试管中。 注：该提取物的颜色应为绿色或黄色;如果样品已经变成褐色，放弃并重新开始。 取粗提物进行免疫印迹的等分试样，加入5×SDS-PAGE上样缓冲液，涡旋，并通过煮沸10分钟的样品在80-100变性 °C下加热块。 3。蛋白免疫沉淀分裂的蛋白质提取物分成两个50ml试管并加入50微升的亲和基质悬浮在缓冲液D以每管。用2小时轻柔旋转孵育在4°C 注：长时间孵育也没有发现增加产量。 通过增加编制600微升的洗脱缓冲液（亲和基质的6倍珠体积）缓冲液D（终浓度）：0.5％BSA，0.25 mg / ml的FLAG肽（抗-FLAG M2琼脂糖）或10mM的D-生物素（为链亲和素琼脂糖）。 注：洗脱不建议在GFP-Trap_A和抗HA矩阵的情况下，所以直接进行在1x SDS-PAGE上样缓冲液中煮沸，步骤3.11。 通过离心分离沉淀的亲和基质，在4℃（5分钟，在1,000×g离心）。 取未结合的提取物进行免疫印迹的等分试样，弃去上清液的其余部分，留下约500μl的在管的底部。 重悬带宽口端部的浆料溶液。 传输从两个管将混合浆料溶液到单个1.5毫升管。 注意：从现在起，使用绑定离心管1.5毫升低蛋白。 脉冲3次，持续5秒使用台式离心机，以沉淀出的亲和基质，去除上清。 洗3到5倍，用1ml冷的缓冲液D的洗涤沉淀之间的亲和力马特里x先前所描述的并丢弃上清液。在最后一次洗涤除去过量的缓冲液D，用注射器的针头。 注意：在使用缓冲液D用0.1％IGEPAL甲最终洗涤可用于进一步减少非特异性结合。 用200微升适当的洗脱缓冲液（抗-FLAG M2或链亲和素琼脂糖见步骤3.2）3次，每次5 min洗脱持续振荡培养。 汇集3洗脱物在单管中。用30微升吸附树脂的浓缩蛋白质。涡，静置5分钟，沉淀出树脂（以10,000×g离心2分钟）。弃上清。 注意：对于GFP-Trap_A和抗HA琼脂糖，跳过步骤3.9和3.10。 加50微升1X SDS-PAGE上样缓冲液中，以沉淀出的亲和度矩阵或吸收树脂。涡和熬在80-100 10分钟 °C下加热块。 离心煮沸亲和基质或树脂为2分钟，在10,000×g下。分装5微升的supernatan的t的免疫印迹，并用其它馏分运行到〜10厘米长的SDS-PAGE凝胶（ 图2）。 用于分离和鉴定磷酸化蛋白的质谱，装入剩余的45微升到〜19厘米长的SDS-PAGE凝胶，如果额外的分离是必要的（ 图2）。 注意：空白车道可以包含所有的样品之间，以减少样品的污染。 4。蛋白质的消化染色用胶体考马斯亮蓝（CCBB）染色的SDS-PAGE凝胶。 注：最小化处理的凝胶，以减少污染与角质。确保没有装备或工具已被用于免疫印迹或可能已经离开残余蛋白污染物的其它活动。 脱色用大量水洗，最好的O / N的凝胶从用干净的刀片凝胶中切感兴趣的频带。 注：对准免疫印迹凝胶如果necessaRY找到正确的区域。作为磷酸化可以延迟蛋白质的迁移在SDS-PAGE紧接的上方和下方所关心的频带切的区域。 切块的凝胶切片成2-4毫米的立方体（这确保了凝胶将不阻塞移液器吸头被覆盖在管的解决方案）。放置在一个试管中。 估计保持良好淹没凝胶所需的音量。使用此金额为衍生，孵化与蛋白酶和肽提取，然后用双三重卷洗。 注意：在一个典型的具有大约100μl的切割凝胶条的消化，用于洗涤500μl的溶液，2×180微升进行脱水，加入150μl的减少，120μl的用于烷基化，和120微升消化。 通过加入50％乙腈（在50mM碳酸氢铵中，ABC）洗凝胶块2×20分钟（或直到脱色）。移液器起飞时注意不要删除凝胶块的解决方案。 脱水用100％乙酰腈5分钟，除去游离的液体。 注：凝胶应该出现萎缩和白色。如果蓝色仍然存在，孵育时间在乙腈/ ABC和/或在升高的温度下（45-55℃）。 减少蛋白质二硫键，加入10 mM的DTT在水中孵育30-45分钟，在56ºC下振荡。除去游离液体。 烷基化的半胱氨酸残基通过加入55 mM的氯乙酰胺（在50mM ABC）20-30分钟（室温，避光）。除去游离液体。 用50％乙腈（在50mM ABC）洗凝胶块2×10分钟。除去游离液体。 脱水凝胶片用100％乙腈5分钟，除去游离的液体。 对于胰蛋白酶消化，加入40微升的胰蛋白酶工作液（在消化缓冲液100毫微克胰蛋白酶：50毫米农行，5％乙腈，平均考马斯亮蓝染色带）。允许凝胶片再水合10分钟。添加的消化缓冲不够的，如果需要覆盖凝胶块。在37ºC的O / N。 停止消化，并从凝胶块中提取的肽，添加5％的甲酸（50％乙腈）（加相同体积的消化量）。超声处理5-10分钟。将上清转移至新管。重复提取3倍。 用冷冻干燥法（首选）或真空浓缩器（如速度，Vac或萨文特）干燥肽。储存于-20ºC。 提交您的样品进行质谱分析。 注：我们提交我们的样品在塞恩斯伯里实验室（英国诺里奇）质谱设施。协议在质谱设施有很大的不同，但通常将肽溶解于0.2％三氟乙酸中含有2％乙腈装载到耦合到电喷雾串联质谱法液相色谱系统之前。