Bir kullanma Pnömokok Kolonizasyon üzerinde Probiyotiklerin Etkileri incelenmesi<em> In Vitro</em> Yapışma Deneyi
Summary
In vitro yapışma deneyleri, hücre mono tabakaları epitel ve bu pnömokokkal kolonizasyonu inhibe etmek için probiyotiklerin kullanımı potansiyel müdahaleler araştırmak için Streptococcus pneumoniae eki incelemek için kullanılabilir.
Abstract
Nazofarenks epitel astar Streptococcus pneumoniae (pnömokok) yapışması kolonizasyonu neden olabilir ve. In vitro deneyler, hücre yapışma epitel pnömokokkinin eki incelemek için kullanılabilir zatürre ve orta kulak iltihabı gibi pnömokok kökenli enfeksiyonları için bir ön koşul olarak kabul edilir ve mono tabakaları, bu tür probiyotiklerin kullanımı potansiyel müdahaleler, araştırmak pnömokokkal kolonizasyonu inhibe. Burada açıklanan protokol (bazen HEp-2 hücreleri olarak da adlandırılır), insan epitel hücre hattı CCL-23, pnömokokkinin yapışması üzerinde, probiyotik Streptococcus salivarius etkilerini incelemek için kullanılır. Deney üç ana adımdan oluşur: epitel ve bakteri hücrelerinin 1) hazırlanması, hücre mono tabakaları epitel bakteri 2) ilavesi ve canlı sayısı (seri seyreltme ve kaplama) ya da kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR yapışık pnömokokkinin 3) tespiti .) Bu technique nispeten basittir ve bir doku kültürü kurulum dışındaki özel ekipman gerektirmez. Deney, diğer probiyotik türler ve / veya kolonizasyon pnömokok potansiyel inhibitörlerini test etmek için kullanılabilir ve kolayca pnömokok yapışma ve yayılım ile ilgili diğer bilimsel soruları için modifiye edilebilir.
Introduction
Streptococcus pneumoniae (pnömokok) pnömoni, otitis media ve menenjit gibi enfeksiyonlara neden olabilen bir Gram pozitif bir bakteridir. Düşük gelirli ülkelerdeki çocukların ve yıllık 1 beş yaşın altındaki çocukların yaklaşık 800.000 kişinin ölümünden sorumlu hastalığın önemli bir nedenidir. Pnömokok sıklıkla genç çocukların nazofarenks yapılmaktadır. Bu kolonileşme genellikle asemptomatik kabul edilir olsa da, bu pnömokok kökenli enfeksiyon takip eder ve insan popülasyonlarında 2'deki bakteriler için bir rezervuar olarak hizmet vermektedir. Pnömokok kökenli konjügat aşısı etkili aşı içinde bulunan serotiplerin taşıma azaltır. Ancak, 90 pnömokok serotipleri üzerinde olan ve aşı serotiplerinin ortadan kaldırılması nonvaccine serotip 3 kaynaklanan taşıyıcı ve hastalık bir artış takip etmektedir, burada serotip değiştirilmesi, yol açabilir. Ayrıca, bazı yüksek riskli popülasyonlarda, pnömokokkolonizasyon genellikle önce ilk aşı dozu 4,5 tatbikatından, çok erken yaşta ortaya çıkar. Son zamanlarda, probiyotiklerin kullanımı pnömokok kolonizasyon 6,7 inhibe etmek için ilave bir strateji olarak teklif edilmiştir. In vitro deneyler, yapışma pnömokokkal yapışmayı 8,9 incelemek için kullanılmıştır. Bu deneyler pnömokok bağlılık 10 probiyotik Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) etkisini araştırmak için adapte edilmiştir.
LGG ve diğer laktik asit bakterileri ek olarak, Streptococcus salivarius, ağız boşluğu, ortak yerleşik nedeniyle potansiyeli ve in vitro 11 pnömokok ve diğer solunum yolu patojenleri inhibe etme yeteneği ile kolonizasyon için solunum yolu için potansiyel bir probiyotik olarak incelenmiştir – 13. Burada sunulan protokol S. etkilerini araştırmak için kullanılan bir bağlılık tahlili tarif Pnömokok bağlılık üzerine salivarius K12insan epitel hücre hattı CCL-23. Büyümesi ve yapışma özellikleri izolatların 10,14 arasında önemli ölçüde değişebilir olarak deneyde kullanılmadan önce, pnömokok izolatı, yapışma özellikleri için değerlendirilmiştir. Pneumococci ve S. büyüme eğrileri salivarius (OD, Şekil 1) optik yoğunluk ile orta log fazı ve tahmini konsantrasyon (koloni oluşturan birim veya CFU / ml) tespit etmek için yapılmıştır. Her deneyde kullanılmadan önce izole edilmesi için uygun bir sayısı ve OD ile büyümesini incelemek için tavsiye edilir. Bu deney, standart doku kültürü tesisleri ve ekipmanları ile herhangi bir laboratuvarda yapılabilir. Bu protokol, S. üç doz etkisi salivarius önce S. uyumda pnömokok ilavesinden 1 saat uygulanmıştır pneumoniae PMP843, bir nazofarenks sürüntü türetilmiş bir serotip 19F taşıma izole incelenmiştir. Yapışık pnömokok ölçmek için iki farklı yol sunulmuştur: caydırmak için kan agar üzerine kaplamamaden canlı sayımları ve DNA ekstraksiyon ve qPCR 15 tarafından pnömokok lytA geninin tespiti. Temel yapışma tahlili protokolü kolay farklı dozlarda ve probiyotik tatbikat süresi test etmek için modifiye edilebilir ve aynı zamanda, diğer bakteri türleri ya da türleri ile kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu tahlilde önemli bir kısmının S. uygun konsantrasyonları katmaktadır bölümlerde 3.1.7 ve 3.1.12 de salivarius ve pneumococci'ye. Konsantrasyonlar OD okumaları kullanılarak tahmin edilir, ancak bir sonraki gün plakalar sayılmıştır kadar tam olarak uygulanması gibi tespit edilmez. Bu nedenle, orta log fazı belirlemek ve OD ile konsantrasyonunun tahmin yardımcı olmak için tahlilde kullanılan tüm bakteriyel suşlar için zamanla OD ve uygun bir sayıları (CFU / ml) ölçmek iç…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Murdoch Çocuk Araştırma Enstitüsü ve Victoria Hükümeti'nin Operasyonel Altyapı Destek Programı tarafından finanse edilerek desteklenmiştir.
Materials
| Minimum Essential Media (MEM) | Thermo Fisher Scientific | SH30244.01 | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30084.03 | ||
| T-75 Flask | Nunc | 156472 | ||
| CCL-23 cells | ATCC | CCL-23 | ||
| Trypsin | Life Technologies | 15090046 | ||
| 24-well cell culture plate | Nunc | 142475 | ||
| Horse blood agar (HBA) plates | Oxoid | PP2001 | Sheep blood agar plates also acceptable | |
| Todd-Hewitt Broth | Oxoid | CM0189 | ||
| Yeast Extract | Beckton Dickinson | 212750 | ||
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141-100MG | ||
| Disposable cuvettes | Kartell | 1938 | ||
| Heparin | Pfizer | 2112105 | comes in sterile ampules at 5,000IU/5mL | |
| sterile spreader | Technoplas | S10805050 | alternatively, a glass spreader can be dipped in 96% ethanol and flame sterilized before each use | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | ||
| Mutanolysin | Sigma-Aldrich | M9901 | ||
| Proteinase K | Qiagen | 19133 | ||
| SDS 20% solution | Ambion | AM9820 | ||
| RNase A | Qiagen | 19101 | ||
| QIAamp DNA mini-kit (250) | Qiagen | 51306 | ||
| LytA F primer | Sigma-Aldrich | Custom made | 5' -> 3' sequence ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA | |
| LytA R primer | Sigma-Aldrich | Custom made | 5' -> 3' sequence TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT | |
| LytA probe | Eurogentec | Custom made | 5' -> 3' sequence Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, alternative fluorophores can be used | |
| Nuclease free water | Ambion | AM9906 | ||
| Brilliant III Ultra Fast QPCR mastermix | Agilent Technologies | 600880 | ||
| Thermo-Fast 96 Detection plate | Thermo Fisher Scientific | AB-1100 | ||
| Ultra clear qPCR cap strips | Thermo Fisher Scientific | AB-0866 | ||
| Mx3005 QPCR System | Agilent Technologies | 401449 | ||
| * alternative sources are available for most/all products listed | ||||
References
- O’Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. Lancet. 374, 893-902 (2009).
- Bogaert, D., de Groot, R., Hermans, P. W. M. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect. Dis. 4 (04), 144-154 (2004).
- Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination. Lancet. 378 (10), 1962-1973 (2011).
- Jacoby, P., et al. Modelling the co-occurrence of Streptococcus pneumoniae with other bacterial and viral pathogens in the upper respiratory tract. Vaccine. 25, 2458-2464 (2007).
- Kwambana, B., Barer, M., Bottomley, C., Adegbola, R., Antonio, M. Early acquisition and high nasopharyngeal co-colonisation by Streptococcus pneumoniae and three respiratory pathogens amongst Gambian new-borns and infants. BMC Infect. Dis. 11, (2011).
- Licciardi, P. V., et al. Protecting against pneumococcal disease: critical interactions between probiotics and the airway microbiome. PLoS Pathog. 8, (2012).
- Popova, M., et al. Beneficial effects of probiotics in upper respiratory tract infections and their mechanical actions to antagonize pathogens. J. Appl. Microbiol. 113 (6), 1305-1318 (2012).
- Pracht, D., et al. PavA of Streptococcus pneumoniae modulates adherence, invasion, and meningeal inflammation. Infect. Immun. 73, 2680-2689 (2005).
- Adamou, J. E., Wizemann, T. M., Barren, P., Langermann, S. Adherence of Streptococcus pneumoniae to human bronchial epithelial cells (BEAS-2B). Infect. Immun. 66, 820-822 (1998).
- Wong, S. S., et al. Inhibition of Streptococcus pneumoniae adherence to human epithelial cells in vitro by the probiotic Lactobacillus rhamnosus GG. BMC Res. Notes. 6 (1), 135 (2013).
- Wescombe, P. A., Heng, N. C. K., Burton, J. P., Chilcott, C. N., Tagg, J. R. Streptococcal bacteriocins and the case for Streptococcus salivarius as model oral probiotics. Future Microbiol. 4, 819-835 (2009).
- Di Pierro, F., Adami, T., Rapacioli, G., Giardini, N., Streitberger, C. Clinical evaluation of the oral probiotic Streptococcus salivarius K12 in the prevention of recurrent pharyngitis and/or tonsillitis caused by Streptococcus pyogenes in adults. Expert. Opin. Biol. Ther. 13 (3), 339-343 (2013).
- Fiedler, T., et al. Protective mechanisms of respiratory tract streptococci against Streptococcus pyogenes biofilm formation and epithelial cell infection. Appl. Environ. Microbiol. 79, 1265-1276 (2013).
- Slotved, H. C., Satzke, C. In vitro growth of pneumococcal isolates representing 23 different serotypes. BMC Res. Notes. 6, 10-1186 (2013).
- Carvalho, M. d. G. S., et al. Evaluation and improvement of real-time PCR assays targeting lytA, ply, and psaA genes for detection of pneumococcal DNA. J. Clin. Microbiol. 45, 2460-2466 (2007).
- Tonnaer, E. L. G. M., et al. Involvement of glycosaminoglycans in the attachment of pneumococci to nasopharyngeal epithelial cells. Microbes Infect. 8, 316-322 (2006).
- Smith-Vaughan, H., et al. Measuring nasal bacterial load and its association with otitis media. BMC Ear Nose Throat Disord. 6, (2006).
- Letourneau, J., Levesque, C., Berthiaume, F., Jacques, M., Mourez, M. In vitro assay of bacterial adhesion onto mammalian epithelial cells. J. Vis. Exp. , (2011).
