一种新型三维流室装置研究生理流量条件下的趋化因子的细胞循环外渗

的3D模型的移动设备可以是一种有用的技术，在各个领域，包括干细胞生物学，血管生物学，血细胞，肿瘤，自身免疫性疾病和炎症的研究。的3D模型的移动设备将是特别有用的研究造血，间充质，神经和其他干细胞的分子机制调节每一个步骤的干细胞外渗级联。研究细胞迁移的研究人员也可以使用这个设备，以检查不同的T细胞和B淋巴细胞，单核细胞，嗜中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，NK细胞，和其它游走细胞迁徙机制。在血管生物学EC的能力，以支持细胞的招募和模仿血脑屏障体外局部微环境的效果评估，该设备将是有益的。对于重点疾病的发病机理的研究人员，该设备可以被用来研究细胞毒性T细胞的迁移到胰腺在I型糖尿病，英里运移进入肺部的哮喘患者中，迁移的嗜中性粒细胞，单核细胞，淋巴细胞到炎症部位的各种疾病，细胞招聘伤口愈合站点，与新生血管的细胞毒性T细胞的相互作用，嗜酸性粒细胞和招聘成肿瘤细胞毒性T细胞。

新颖的3D设备也将是一个有用的工具，转化科学和临床前药物开发和筛选。例如，该设备可以被用于优化制备用于静脉内给药的治疗的细胞悬浮液，测试招聘受伤组织与正常组织相比，治疗细胞，并审查的特定器官或组织的内皮细胞和微环境中的作用的过程。药物开发中，该装置可以用于测试候选药物靶肿瘤细胞和阻止外渗级联反应的每一步，测试作为药物传递的细胞迁移Ý车辆肿瘤部位，测试药物，调节人体器官特异性的血管内皮细胞或局部组织的特定的微环境的功能，并进行测试的药物的组合，调节不同的步骤回归级联。最后，当被转换为高吞吐量的系统，该设备可以用于筛选的小分子，肽，抗体，该抗体介导细胞的运输目标分子。

技术细节和技巧

流动条件下的滚动和粘附外渗级联的关键步骤，并作出显著贡献到体内细胞迁移的效率。值得注意的是，这些措施不利于在体外的静态检测。然而，静态轮回检测可作为阴性对照实验中，测试剪切应力的影响，对细胞的存活和功能包括EC的能力，以支持低亲和力相互作用（轧）和粘附牢固。

介质的实验中的3D模型的移动设备的选择是重要的。媒体包含不同的生长因子可能影响循环细胞的生存，尤其是在孵化时间长。此外，该浓度的Ca ^{2 +}和Mg ^{2 +的} ，这可能会影响粘合剂的相互作用的生理流动条件下，有很大的不同商业培养基。规划与3D模型的移动设备的实验时，应考虑此技术细节在下面讨论。

EC单层的选择

签名EC细胞表面受各种参数的影响，包括物种和组织中的起源和细胞培养条件，应考虑到设计的实验。一些常用的EC包括来自肺微血管EC（LDMVEC），骨髓来源的EC（BMDEC），脑源性EC（BDEC），和人脐静脉内皮细胞。EC的特性也各不相同，他们的起源。例如，组成BMDEC快递选择素和VCAM-1，这是负责的滚动和粘附，而BDEC，LDMVEC，和人脐静脉内皮细胞不表达这些分子在正常情况下。因此，插入涂有BDEC LDMVEC，和人脐静脉内皮细胞与TNF-α（10毫微克/毫升，4小时），或其他因素，以模仿炎症和诱导表达的归巢分子进行预处理。

局部微环境试验串扰

有越来越大的兴趣，了解局部微环境调节功能EC和参与细胞外渗。我们的研究结果表明，插入下方的EC单层基质细胞单层显着增加循环细胞外渗。这一发现表明，EC和基质之间的串扰提高欧共体的能力，以支持循环细胞外渗。不仅如此版，插入不同的微环境（ 例如，间充质干细胞，肺成纤维细胞，肿瘤细胞，星形胶质细胞）的细胞，可有助于模仿特定的血管床。特别是，脑源性EC胶质细胞和星形胶质细胞的组合可能是一个有用的方法来模仿血 – 脑屏障。同样，细胞取自患者或正常细胞在体外操纵，可以帮助患病模仿一个特定的微环境。

在我们的研究中，我们使用较低的插入基质细胞生长至50％汇合。尽管最佳的插入件上的微环境的细胞密度将取决于研究的目标，这可以很容易地操纵和控制。

选择剪切应力速率

0.8达因/厘米²的剪切应力，在这里使用，因为这已被证明由Von安德里安等 。的剪切应力是在骨髓中microvasculature，其中造血祖细胞的正常生理条件下¹⁵退出流通，并进入组织。与此相反，观察到更高水平的剪切应力在较大的容器，是有限的细胞外渗。因此，高的剪切应力率可以作为额外的控制各种细胞类型的实验研究外渗。

剪切力作用下的细胞的生存取决于几个因素，包括细胞类型和体外细胞治疗（察洛娃等人，未出版的观察），并且在测试过程中，因此，应该仔细评估。可评价细胞的敏感性不同水平的剪切应力（剪应力阻力），通过编程的蠕动泵，以增加从0.8达因/厘米²到6达因/厘米²的剪切应力速率增量。在这些测试中，细胞可以定期收集从气体交换室监测细胞死亡，使用作为说，如台盼蓝排斥，膜联蛋白V和PI染色，细胞凋亡标记的表达。

如果试验是设计用来测试体外基因工程细胞的细胞是来自于薄壁的剪切应力的阻力，它是建议，包括额外的阳性对照，如血源性细胞，在实验中。

选择插入孔径和ECM涂层

刀片有很多的孔隙体积（3，5，和8微米）。孔径大小的选择将依赖于循环的试验细胞的大小和性质的，这也是静态Transwell小室测定的情况下。建议用大孔径（8微米）插入到测试的大细胞，如上皮来源的肿瘤细胞外渗。白细胞或造血干细胞更常见的测试与5微米的孔插入，最好将其保留测试的s外渗的3微米孔径的插入小光伏电池。然而，单独测试单元尺寸是不是唯一重要的因素，我们建议测试插入几个孔径。

在我们最初的研究中，我们测试了各种ECM他们的能力，以支持经济增长的EC，插入和承受剪切应力> 4小时。 ECM测试包括基底膜，聚-D-赖氨酸，纤连蛋白，层粘连蛋白，键入I型胶原，水凝胶，元角质I，II，III，IV，和Extracel。 EC生长提供了最好的结果，得到与Extracel，纤连蛋白和胶原蛋白。然而，在我们的手中，在0.8微克/厘米² Extracel显着降低轮回测试细胞穿过细胞膜。因此，我们现在使用的纤连蛋白（10微克/厘米^2）或胶原蛋白（5微克/厘米^2）的涂层的插入。然而，细胞外基质的最优选择可能会影响不同的EC和transmigratory的性能的测试电池。应进行的初步实验测试完整性性EC单层生长在选定的ECM。例如，预包被的地方插入EC单层在装有培养基的培养皿中，放置在摇动器上的菜创建剪切应力（低设定），并置于37℃和5％CO ₂的12小时。使用结晶紫染色，可以评估的完整性EC暴露后的剪切应力。

选择最佳测试细胞浓度的

测试细胞退出流通的能力取决于诸多特点，具体到每个细胞类型。要产生统计上显着的结果，循环细胞密度必须进行优化，以确保有足够数量的细胞迁移到阳性对照井。因此，我们建议执行初始测试理解之间的关系的细胞数加载到系统中，并与细胞密度的范围内（ 例如，10 ³个/ ml〜10 ⁷个/ ml）细胞经过轮回。

此外，循环的最佳浓度可从不同来源获得的相同的细胞类型不同。例如，CD34 ⁺细胞是含有造血干细胞和提交的谱系特异性祖细胞的细胞种群异构。他们可从骨髓动员的外周血和脐带血。来自这三个来源的CD34 ⁺细胞具有不同的归位和嫁接能力^16-18，因此在3D模型的移动设备测试这些细胞的条件满量程的研究之前应进行优化。

选择最佳的细胞循环时间

最佳的流通时间应根据经验来确定对每个小区不同。循环所需的最短时间可以从静态迁移实验的结果推算，但是这可能是EXTEN副执行干事当细胞受到剪切应力。试点研究测试循环次数在4和96小时之间。

气体交换部

气体交换单元的主要目的，是在介质中，通过3D的移动设备中循环，类似于标准的组织培养孵化器中的设置以保持最佳的CO ₂浓度。气体交换的单元，也可用于加入的试验细胞的化合物，并在测试过程中，收集探针和样品。

评价测试细胞数

循环细胞可以在不同时间取样，在实验过程中通过气体交换单元。在实验结束时，留在循环的细胞可收集从插座拔出。在实验结束时，当3D设备拆卸转生细胞可以从较低的井收获和收集f或进一步分析。如果输入细胞是未标注，将的转生细胞可以与台盼蓝染色，死/活细胞显微镜列举。或者，输入单元可以被标记为与许多“小区跟踪器”，然后加载到3D模型的移动设备可用于活细胞成像的染料之一，在这种情况下，收获transmigrated应定量荧光裂解细胞。

最佳样本大小的选择

以允许统计分析，必须选择的样本大小，将提供约80％的功率，以检测在两组的平均百分比的变化进行测试时，在使用一个双面的t检验的显着性水平为0.05的假设差异。根据我们的经验与骨髓细胞，我们使用三种实验条件下的井每为3D设备实验。然而，最佳样本大小将随实验的目标，应确定ë键mpirically。可以使用多元回归统计测试，双面t-检验，方差分析，以验证结果的统计相关性。

趋化因子的选择

的所有轮回试验，趋化因子的选择将取决于测试单元的属性和研究目标。 SDF-1是一个完善的造血干细胞的趋化。在我们手中，浓度为50 ng / ml的SDF-1的最佳刺激骨髓来源的造血祖细胞的外渗。我们还使用C3a和碱性成纤维细胞生长因子间充质干细胞的趋化因子^19。不过，我们建议一个全面的研究之前，滴定跨滴定每个趋化因子和趋化因子的组合，以确定最佳的浓度范围。对于某些类型的细胞，趋化因子的组合可能是有益的。如果特定的测试细胞的趋化因子是未知或不可用，CON刺激淋巴细胞，成纤维细胞和其他细胞的ditioned媒体可以用来作为源的趋化因子。

读出的参数的选择

3D设备的多功能性将扩大类型的轮回可以进行实验，实验的成功将取决于周到的考虑和设计参数读出。作为一个规则，从上部隔室（循环）收集细胞，细胞计数在同一时间，较低的（静态的）隔室应检测的可行性。有些细胞具有较低的微血管中观察到的生理剪切应力的耐受性。在这种情况下，死细胞的数量将增加在上层车厢。贴壁细胞的数量逮捕（或被困）EC层可以进行评估，测试细胞特异表达的免疫细胞化学标记。可以使用特异的抗体CD31和vWF检测到EC和允许测试细胞和EC之间的歧视。此外，在每次试验结束时，应监测EC单层的完整性。

收集到的细胞进行分析的类型将取决于研究者的实验目标，但可以包括芯片和定量PCR，流式细胞仪分析表面分子的表达，用流式细胞仪和免疫印迹的信号通路的激活，和因子分析基因表达的变化采用ELISA法的分泌。功能测试是一个巨大的阵列可能收集到的细胞在体外 ，证明了我们自己的工作中，我们培养转生列举骨髓细胞的造血祖细胞（ 图3）。收集到的样本也可在体内试验中测试了多种。

一个重要的参数，可以帮助预测测试细胞在体内的行为，是倾向于一些细胞ENCY形成聚集体，在不同的速率下的剪切应力。例如，治疗的细胞，在3D模型的移动设备进行聚集物的形成可能会产生较大的倾向，形成团块静脉内给药后， 在体内引起急性血管阻塞（察洛娃等人，未出版的观察）。聚集物的形成，可以通过采样过程中或完成后的三维装置实验测试细胞显微镜监测。