Nucleases designers, tais como as nucleases de dedos de zinco (ZFNs) e activadores de transcrição, tal como nucleases efectoras (TALENS) pode ser utilizado para modificar o genoma de embriões préimplantação de ratinho por desencadear tanto a extremidade não homóloga de união (NHEJ) e recombinação homóloga (HR) vias. Estes avanços permitir a rápida geração de ratinhos com modificações genéticas precisas.
Camundongos transgênicos portadores modificações específicas do local do genoma (ko, batida-in) são de vital importância para dissecar sistemas biológicos complexos, bem como para a modelagem de doenças humanas e testar estratégias terapêuticas. Os recentes avanços no uso de nucleases de designer, tais como nucleases dedo de zinco (ZFNs), ativador de transcrição-como nucleases efetoras (Talens), e os aglomerados se repete regularmente palindrômicas curtas intercaladas (CRISPR) / (CAS) associada à CRISPR 9 sistema para o local- engenharia genoma específico em aberto a possibilidade de realizar rápida modificação do genoma segmentado em praticamente qualquer espécie de laboratório, sem a necessidade de contar com caule embrionárias (ES) tecnologia celular. Uma edição experimento genoma tipicamente inicia-se com a identificação de locais alvo de nuclease designer dentro de um gene de interesse, seguido por construção de domínios de ligação de ADN personalizados para dirigir a actividade de nuclease para o locus genómico definido pelo investigador. Plasmídeos nuclease Designer são in vitro </ Em> transcrito para gerar mRNA para microinjeção de oócitos fertilizados de camundongo. Aqui, nós fornecemos um protocolo para alcançar a modificação do genoma alvo de injeção direta de TALEN mRNA em oócitos fertilizados de camundongo.
Os ratos são, de longe, a plataforma mais popular para a geração de modelos de animais transgênicos. A caixa de ferramentas versáteis para a engenharia genética do embrião de rato 1-3 foi recentemente prorrogado por abordagens edição do genoma com base em nucleases designer, tais como nucleases dedo de zinco (ZFN) 4-6, transcrição nucleases efetoras ativador-like (Talen) 7,8, e os aglomerados regularmente intercaladas repete palindrômicas curtas (CRISPR) / (Cas) 9-associados CRISPR sistema 9. ZFN e função TALEN como pares de dois domínios de design personalizado à base de proteína de ligação a DNA (arrays de proteínas dedo de zinco e repetem-variable di-resíduos (RVDS), respectivamente), que são todos acoplados ao endonuclease FokI 10-12. Por outro lado, a especificidade de clivagem de ADN mediada por Cas9 é fornecido pela transactivação RNAs CRISPR (crRNA e tracrRNA, que também podem ser combinadas numa única molécula de ARN quimérico guia de ARN denominado 11) que age em complexo com oProteína CRISPR.
Talens com uma seqüência definida de RVDS podem ser rapidamente construído por pesquisadores individuais, com uma multiplicidade de estratégias de montagem para escolher 13-17. CRISPR/Cas9 promete ainda menor geração de trabalho intensivo de nucleases grife, no entanto, a especificidade da guia de RNA-DNA de ligação ainda não está completamente resolvido 18,19. Geração de ZFNs personalizados até agora tem sido limitado a laboratórios acadêmicos especializados e fornecedores comerciais, como Sangamo Biosciences eo serviço Sigma CompoZr.
Em geral, o genoma edição com nucleases grife visa introduzir vertente quebras duplas (DSB) em loci genômico definido, que, posteriormente, atrair final não homóloga juntar (NHEJ) ou recombinação homóloga (HR) máquinas de reparo do DNA 10,12. Reparação NHEJ-mediada de um DSB muitas vezes resulta na introdução de inserções e deleções, em estreita proximidade ao local de reparação. Assim NHEJ reparação cum ser explorada para bater para fora a função de um gene-alvo através da introdução de uma mutação frame-turno dentro do genes codificadores de proteínas seqüência 4,7,9. Alternativamente, a adição ou substituição de informação genética definida podem ser conseguidos proporcionando um doador de ADN em conjunto com as nucleases de design. Um doador de ADN compreende sequências de ADN concebidas para o investigador flanqueadas por regiões de homologia com o locus alvo, servindo assim como um molde para a reparação de DSB por HR. Ambos os plasmídeos 5,6,20 e de fita simples oligonucleotídeos 8,9,21 têm sido utilizados com sucesso como doadores. Nem NHEJ-nor genoma edição mediada por AR exigir a introdução de um marcador seleccionável para o genoma do embrião de rato, o que faz com que essas estratégias particularmente bem adequado para a criação de pequenas alterações na sequência de nucleótidos, sem perturbar a arquitectura genética global.
Neste protocolo, descrevemos todos os procedimentos essenciais para a edição de genoma naembrião de rato usando Talens. Estes incluem: 1) identificação de um site de destino TALEN 22, 2) construção de Talens por clonagem Golden Gate 13, 3) síntese in vitro de TALEN mRNA, 4) microinjeção de TALEN mRNA em oócitos de camundongos fertilizados, 5) procedimentos cirúrgicos para transferência de embriões e 6) a análise de mutagénese induzida por TALEN em animais fundadores. Nós nos concentramos em microinjeção TALEN mRNA e triagem dos fundadores para induzidas NHEJ inserções / exclusões. Para este fim, geraram construções talen bifuncionais que permitem tanto a expressão em células de mamíferos quando transfectado como plasmídeos e na síntese in vitro do ARNm TALEN para microinjecção em embriões de ratinho. Estas construções compreendem um backbone CONTO truncado 23 fundido a heterodimeric FokI domínios 24,25 para a edição genoma ideal em células de mamíferos. Este protocolo também pode ser adotado para microinjeção de outras nucleases grife ou por injeções combinadas de nucleases grifee construções doadores (projeto de doadores de DNA tem sido descrita em excelentes publicações técnicas por Wefers et al. 26,27).
Declaração de ética
Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos do Instituto Cantonal de Veterinária da Cantão de Zurique.
Orientada por nuclease Designer genoma abordagens edição estenderam significativamente a gama de espécies passíveis de alterações específicas dos respectivos genomas 10,12. Em ratinhos, em células ES de direccionamento de genes tem sido uma técnica padrão para mais de duas décadas; no entanto, tem sido difícil para se adaptar às células-tronco embrionárias de outros do que o mouse espécies, embora tenha havido algum sucesso recente em ratos células-tronco embrionárias. Mesmo com a disponibilidade de "off-the-shelf" rato ES clones de células alvo de genes fornecidos por consórcios como EUCOMM, KOMP ou NorCOMM 3 genoma edição por ZFN e TALEN proporciona maior precisão e flexibilidade em relação ao espectro de modificações que podem ser introduzida no genoma do rato. Animais fundadores portadores de mutações mediada por nuclease parece ser altamente germe linha competente 4-6,20,21, o que nem sempre é o caso para as quimeras provenientes injecções blastocisto de células ES. Assim, em certos casos, a microinjecção de desnucleases Igner pode resultar em geração significativamente mais rápido de novas linhas de mouse com modificações do genoma direcionados.
A geração bem sucedida de camundongos knockout por injeção de ZFN e TALEN depende, em grande medida, da atividade do par nuclease injetado. TALENS tenham demonstrado ter uma elevada taxa de sucesso em atingir uma grande variedade de genes em vários organismos; No entanto, estudos recentes sugerem que a ligação é sensível ao TALEN metilação da citosina 30,31. Assim, os pares de nuclease recém-gerados, por exemplo TALENS clonado em vectores pCAG-T7, pode ser transfectada de forma transiente numa linha de células de rato tais como NIH-3T3 ou Neuro -2a, que imitam o estado da cromatina do embrião de rato, em certa medida. Aqui, a atividade nuclease pode ser estimada utilizando o ensaio endonuclease T7 ou uma restrição resumo de produto de PCR, como descrito na seção 5 antes da síntese de mRNA e microinjeção. Recomendamos seqüenciamento da região genômica de interesse no que diz respeitoive linha celular ea tensão do rato usado para experimentos de microinjeção.
Em zigotos murinos, diferentes pares talen ou ZFN funcionará optimamente a diferentes concentrações de mRNA e, por conseguinte, a concentração de trabalho óptima do ARNm de nuclease microinjectado podem ter que ser determinadas experimentalmente. Dependendo do par de nuclease, uma concentração demasiado baixa irá resultar em nenhuma clivagem enquanto demasiado elevada pode resultar na letalidade de embrião. Dependendo do par de nuclease, tivemos sucesso utilizando as concentrações de mRNA total de tão baixas quanto 2 ng / mL e tão alta quanto 200 ug / ul. Estes efeitos são difíceis de prever a partir de experiências em cultura de células e a concentração óptima de nuclease para a sobrevivência do embrião e taxa de alteração do locus alvo precisa de ser determinada empiricamente.
ZFN altamente ativa ou TALEN pode unir sua seqüência alvo além do estágio de uma célula do embrião microinjeção e, assim, causar padrões complexos de mutagênese umd mosaicismo em fundadores. Nós e os outros quatro têm observado três ou mais alelos mutantes distintos em um único fundador (Figura 5C). Assim, ao estabelecer uma nova linha de rato a partir desses fundadores, filhos devem ser cuidadosamente selecionados por sequenciamento para a presença da mutação favorável desde que os ensaios de digestão fornecem evidências de que apenas uma mutação indefinido está presente.
Uma das críticas frequentemente manifestadas contra os sistemas de ZFN e talen é a possibilidade de que estas nucleases são também capazes de clivagem de sequências presentes em outro lugar no genoma, que são semelhantes aos sítios alvo. Tais efeitos fora do alvo têm sido observados com reagentes primeira geração usando o domínio homodimérico FokI e construções heterodímero foram projetados para aliviar os efeitos fora do alvo 25. Locais fora do alvo potencial podem ser previstos, em certa medida in silico 32,33 e rastreados por PCR e sequenciação. Uma vantagem óbvia of usando ZFNs TALENS e para a geração de ratinhos em vez de linhas de células é a possibilidade de remoção de fora mutações alvo não ligados a modificação do genoma desejado realizando retrocruzamentos a uma estirpe de tipo selvagem de escolha. Para a análise de um grande número de ratinhos progenitores, a próxima geração de profundidade sequenciação dos produtos de PCR gerados a partir do locus alvo de nuclease e in silico previsto fora do alvo loci pode oferecer uma leitura qualitativa e quantitativa alternativa aos ensaios de digestão dos produtos de PCR.
As técnicas de reprodução assistida descritos neste protocolo são otimizados para cepas padrão de mouse usados para experimentos de microinjeção, como C57Bl/6J ou B6D2F1. Ratos de diferentes origens, como cepas outbred, pode, em princípio, ser utilizada para abordagens edição do genoma e pode fornecer um fundo genético mais adequado para questões de pesquisa específicas. O desempenho de técnicas de reprodução assistida, como a superovulação pode ser predicted para um número de estirpes de 34-36, mas pode requerer mais de optimização para estirpes diferentes do padrão, a fim de se obter um número suficiente de embriões para nuclease microinjecção.
Para além ZFN e TALEN, novas nucleases grife como o sistema CRISPR/Cas9 guiado RNA-9,37,38 foram agora introduzidas para aplicações de edição de genoma. Todos os métodos para a microinjecção e análise de animais fundadores aqui descritas são também aplicáveis aos CRISPR/Cas9 e modos futuros de edição genoma.
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer a Monika Tarnowska, Cornelia Albrecht, e Ewa Skoczylas pela excelente assistência técnica. Este estudo foi financiado pela SNF Sinergia concessão CRSI33-125073 para PP.
BsaI | NEB | R0535S or L |
Esp3I | Thermo Scientific | ER0451 |
T4 Ligase | NEB | M0202S or L |
Spectinomycin | Sigma | S0692-1ML |
Ampicillin | Sigma | A0166 |
X-Gal | Sigma | B4252 |
IPTG | Sigma | I6758 |
Plasmid-Safe nuclease | Epicentre | E3101K |
QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 |
QIAGEN Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 |
mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit | Invitrogen | AM1345 |
NucAway Spin Columns | Invitrogen | AM10070 |
RNaseZAP | Sigma | R2020-250ML |
NorthernMax Formaldyde Load Dye | Invitrogen | AM8552 |
RNA Millennium Markers | Invitrogen | AM7150 |
10x TBE buffer | Thermo Scientific | B52 |
T7 endonuclease | NEB | M0302S or L |
pGEM-T EasyVector System I | Promega | A3600 |
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S-7563 |
pregnant mare's serum gonadotrophin (PMSG) | Sigma | G4877 |
human chorionic gonadotropin (hCG) | Sigma | CG5 |
M2 embryo culture medium | Sigma | M7167 |
M16 embryo culture medium | Sigma | M7292 |
Mineral oil, embryo tested | Sigma | M8410 |
Ketamine | CentraVet | Ket 201 |
Xylazine | Sigma Aldrich | 46995 |
Equipment/Tools | ||
Inverted microscope with Nomarski DIC optics (for example Nikon Eclipse TE200) | Nikon | |
Micromanipulator units (for example Narishige, NT88NF) | Narishige | |
Embryo holding capillaries | Sutter instruments | B100-75-10 |
Embryo injection capillaries | Narishige | GD-1 |
Capillary puller (for example Sutter P97) | Sutter instruments | |
Microforge (for example Narishige MF-900) | Narishige | |
Walton skin scissors | FST | 14077-10 |
Surgical scissors | FST | 14041-10 |
Surgical probe | FST | 10140-03 |
Reflex wound clip system (9mm) | FST | 12031-09 |
Reflex wound clips (9mm) | FST | 12032-09 |
Dumont fine forceps 5 | FST | 11254-20 |
Moria curvrd forceps | FST | 11370-31 |
Moria fine forceps | FST | 11399-80 |
Dietrich bulldog clamp | FST | 18038-45 |
Animals | ||
C57BL/6J mice | Jackson labs | strain code 000664 |
CD-1 mice | Charles river | strain code 000664 |