Uso De pHluorin Para Evaluar La Dinámica De Los Receptores De Orientación Axón En El Cultivo Celular Y En El Embrión De Polluelo

Durante su navegación, los axones integran múltiples señales ambientales que los guían hacia su objetivo. Estas señales activan los receptores de guía en la superficie de los terminales de los axones, los conos de crecimiento, que a su vez inician una vía de señalización adecuada. Por lo tanto, la regulación temporal y espacial de la distribución de la superficie celular de los receptores es fundamental para establecer la sensibilidad del cono de crecimiento^1. En este contexto, el cruce de la línea media por axones comisurales es un excelente modelo para investigar la regulación de los niveles de superficie celular del receptor. En la médula espinal en desarrollo, los axones commissurales son inicialmente atraídos hacia la placa del piso ventral donde cruzan la línea media. Después del cruce, pierden su capacidad de respuesta a los atrayentes de la placa del piso y ganan respuesta a los repelentes de la placa del piso para que puedan salir de la placa del piso y navegar hacia su destino final en el lado contralateral del sistema nervioso^2,3. La regulación de la disponibilidad del receptor en la superficie del cono de crecimiento es uno de los mecanismos subyacentes al cambio de capacidad de respuesta a las señales de la línea media^4,5. Por lo tanto, la monitorización selectiva de los receptores presentes en la membrana plasmática de los conos de crecimiento es de primordial importancia. Se describe aquí un método basado en la propiedad de fluorescencia dependiente del pH de una proteína fluorescente verde (GFP) variante para visualizar específicamente los receptores de guía axón que se dirigen a la membrana plasmática in vitro e in vivo,en el desarrollo de la médula espinal polluelo.

Rothman y sus colegas diseñados por mutaciones puntuales variantes sensibles al pH de GFP, incluida la eclíptica pHluorin^6. La pHluorgina eclíptica tiene la propiedad de ser no fluorescente cuando se expone al pH ácido (<6), mientras que es fluorescente a pH neutro. Esto permite distinguir los receptores no fluorescentes localizados en compartimentos ácidos intracelulares(es decir, endosomas, vesículas de tráfico) de los receptores fluorescentes incorporados a la membrana plasmática y, por lo tanto, expuestos al pH neutro extracelular^7. Aprovechamos esto para monitorizar la localización de la membrana plasmática de plexinA1, un receptor de guía axón que media la respuesta del cono de crecimiento a la semaforina repelente de línea media 3B⁵ (Figura 1A). Se describe aquí la caracterización in vitro de una construcción de pHluorin-plexinA1, junto con en ovo electroporación^8-10 de esta construcción en la médula espinal polluelo en desarrollo seguido por el análisis microscópico de criosecciones que permiten seguir la dinámica del receptor de orientación axón in vivo con resoluciones espaciales y temporales.