Gebruik van pHluorine om de dynamiek van Axon Guidance Receptoren in celcultuur en in het kuikenembryo te beoordelen

Tijdens hun navigatie integreren axonen meerdere omgevingssignalen die hen naar hun doel leiden. Deze signalen activeren geleidingsreceptoren aan het oppervlak van axonterminals, de groeikegels, die op hun beurt een geschikte signaleringsroute initiëren. De temporele en ruimtelijke regulatie van de celoppervlakverdeling van de receptoren is dus van cruciaal belang om de gevoeligheid van de groeikegel in te stellen¹. In deze context is midline crossing door commissural axons een uitstekend model om de regulering van receptorceloppervlakniveaus te onderzoeken. In het zich ontwikkelende ruggenmerg worden commissural axonen in eerste instantie aangetrokken naar de ventrale vloerplaat waar ze de middellijn oversteken. Na het oversteken verliezen ze hun reactievermogen op de vloerplaattrekkers en krijgen ze reactie op vloerplaatafstotende middelen, zodat ze de vloerplaat kunnen verlaten en naar hun eindbestemming kunnen navigeren in de contralaterale kant van het zenuwstelsel^2,3. Regulering van de beschikbaarheid van receptoren aan het groeikegeloppervlak is een van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de omschakeling van responsiviteit naar middellijnsignalen^4,5. Selectieve monitoring van de receptoren die aanwezig zijn op het plasmamembraan van groeikegels is dus van het grootste belang. We beschrijven hier een methode gebaseerd op de pH-afhankelijke fluorescentie-eigenschap van een groene fluorescerende eiwit (GFP) variant om specifiek de axongeleidingsreceptoren te visualiseren die in vitro en in vivozijn gericht op het plasmamembraan , in het zich ontwikkelende kuikenmerg.

Rothman en collega’s ontworpen door puntmutaties pH-gevoelige varianten van GFP met inbegrip van de ecliptica pHluorine⁶. Ecliptica pHluorine heeft de eigenschap nietfluorescent te zijn bij blootstelling aan zure pH (<6), terwijl het fluorescerend is bij een neutrale pH. Hierdoor kunnen niet-fluorescerende receptoren die gelokaliseerd zijn in intracellulaire zure compartimenten(d.w.z. endosomen, blaasjes) worden onderscheiden van fluorescerende receptoren die in het plasmamembraan zijn opgenomen en dus worden blootgesteld aan de extracellulaire neutrale pH⁷. We hebben hiervan gebruik gemaakt om de plasmamembraanlokalisatie van plexineA1 te controleren, een axongeleidingsreceptor die de reactie van de groeikegel op de middellijnafstotende semaphorine 3B⁵ (figuur 1A)bemiddelt. We beschrijven hier de in vitro karakterisering van een pHluorine-plexineA1 constructie, samen met in ovo elektroporatie^8-10 van deze constructie in het zich ontwikkelende kuiken ruggenmerg gevolgd door de microscopische analyse van cryosecties die het mogelijk maken om de axongeleidingsreceptordynamiek in vivo te volgen met zowel ruimtelijke als temporele resoluties.