Arabidopsis Kök Gravitropic Müdahale Yüksek çözünürlüklü Zaman lapsed Resim Toplama Masaüstü Tarayıcılar kullanma
Summary
Bu protokol, ticari olarak temin edilebilen düz yataklı tarayıcı kullanılarak bir yerçekimi uyarana yanıt Arabidopsis fide görüntülerin hızla toplanması için bir işlemi tarif etmektedir. Yöntem aşağı analiz algoritmaları için mükellef yüksek çözünürlüklü görüntüleri, ucuz, yüksek hacimli yakalamak için izin verir.
Abstract
Biyoloji araştırma çabaları giderek daha yüksek çözünürlüklü verilerin yüksek hacimli toplamayı sağlayan yöntemlerin kullanılmasını gerektirir. Laboratuarlar yüz olabilir bir meydan okuma bu yöntemlerin geliştirilmesi ve başarıdır. Ilgi sürecinde fenotipleri Gözlem gen işlevini okuyan araştırma laboratuarları tipik bir hedefi olduğunu ve bu genellikle görüntü yakalama yoluyla elde edilir. Görüntüleme yaklaşımlar kullanılarak gözlem için uygun olan özel bir işlem olup, ağırlık vektör ile aynı hizada yerinden edilmiş bir fide kökünün düzeltici büyümesidir. Kök gravitropic tepkisini ölçmek için kullanılan görüntüleme platformlar, pahalı verim nispeten düşük ve / veya emek yoğun olabilir. Bu sorunlar, ucuz, ancak yüksek-çözünürlüklü, masaüstü tarayıcılar kullanarak yüksek verim görüntü yakalama yöntemini geliştirerek ele alınmıştır. Bu yöntemi kullanarak, görüntüler 4.800 dpi her birkaç dakikada yakalanabilir. Geçerli kurulum 216 bireysel r toplanmasını sağlayanGünde esponses. Toplanan görüntü verileri görüntü analiz uygulamaları için yeterli kaliteye sahip.
Introduction
Yüksek çözünürlüklü fenotipik veri toplama organizma işlevi 1,2 aracılık genetik etkileşimi ve çevresini anlamasını amaçlayan çalışmalarda yararlıdır. Bu tür çalışmalar, ek gerekli bu bağlamda fenotipleri ölçmek için kullanılan yöntemler, yüksek verim 3,4 olması yapımında, ölçek de doğal olarak büyüktür. Phenomics ölçekli araştırma yöntemleri kurulmasında, hacmi ve çözünürlük arasında makasına devreye girer. Geçirilendeki yüksek yöntemler de daha zor genetik ve çevre 5 küçük etkileri algılamak için yapım, çözünürlük düşük olma eğilimindedir. Alternatif olarak, daha dikkatli arzu edilen bir fenotip ölçen yöntemler de zor geniş genetik ve çevresel etkilerini anket yapma, verim düşük olma eğilimindedir. Ayrıca, görsel inceleme dahil miktarının fenotipleri, için manuel yöntemler nedeniyle insan Başı farklılıklara varyasyon konusu olabilirception 6.
Görüntüleme teknolojileri fenotipik olarak gözlem 7-9 elde hacmi ve çözünürlük arasında yararlı bir köprü sağlayabilir. Genel olarak, bir görüntü hacmi kolaylaştıran yakalamak için nispeten kolaydır, ve yeterli çözünürlükte alındığında, ince fenotipleri 1,2,7 tespit edilebilir. Görüntüleme teknolojileri ilgilendiren bir sistemi ya da süreci uygun değiştirilebilir olma eğilimindedir ve genellikle 10-12 ölçeklenebilir. Bu nedenle, görüntüleme teknolojileri organizma işlevi büyük ölçekli çalışmalar gelişimi için idealdir.
Bir ağırlık uyarıcı birincil kök cevabı, morfolojik olarak basit bir organ içinde meydana karmaşık bir fizyolojik bir süreçtir. Tepki kök organı yoluyla yaymak ve ilerleme ortamı 12-14 etkisinde genetik faktörler de dahil olmak üzere çevresel ve genetik faktörler tarafından belirlenir sinyal yollarının aktivasyonunu içerir </sup>. Bir yerçekimi uyarana birincil kök yanıtı Darwin'den bu yana en az çalışılmış, ama nasıl çalıştığı hakkında bilgi edinmek için çok özellikle erken sinyal olaylar ve müdahale plastisite 12,14,15 aracılık faktörler vardır. Bu yanıtın dinamiklerinin ayrıntılı bir anlayış kazanıyor başarıyla belirli bir ortamda 16 içinde kurulmuş olmak için fidan yeteneğini geliştirmek için yollar bulmak önemlidir. Buna ek olarak, kök şekli müsait görüntü işleme uygulamaları 8,12,17 için yapar. Birlikte ele alındığında, kök gravitropic tepki organizma fonksiyonu genomik düzeyinde çalışmalar yürütülmesi amacıyla yüksek verimli görüntüleme teknolojisinin gelişimi için ideal bir sistemdir.
Bu raporda, ucuz, piyasada mevcut dorse tarayıcıları kullanarak kök gravitropic tepki görüntü yakalamak için yüksek verimlilik, yüksek çözünürlüklü bir yöntem sunulmaktadır. Bir bakışprotokol, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Agar plakaları üzerinde dikilen fidanları özel pleksiglas plaka sahipleri ile donatılmış dikey odaklı dorse tarayıcılar üzerinde konumlandırıldı. Görüntüler 4,800 dpi her birkaç dakikada toplanan ve yerel bir sürücü veya veri sunucu üzerinde kaydedildi. Her resim serisi ile ilişkili metadata bir veritabanında saklanır ve saklanan görüntüler işlenir. Yaklaşım, görüntü yakalama için birisidir yazılımı kullanır. VueScan (Malzeme bkz. Tablo) Windows, Mac veya Linux işletim sistemleri üzerinde 2.100 farklı tarayıcılar çalıştırmak için kullanılabilir. 4.800 dpi bir tarayıcı çözünürlüklü sabit kameralar CCD 1,8,12 kullanarak daha önceki çalışmalarda elde çözünürlüğü maç bu uygulamada kullanılmıştır. Ortak bir arayüz ile birlikte birisidir yazılımının esnekliği kullanıcıların kolaylıkla bu yazıda sunulan protokole yeterli çözünürlükte hemen her tarayıcı donanım benimsemeye olanak çalışan herhangi bir tarayıcı için kullanır. Cari çıktı toplanması için izin verirGünde 216 bireysel yanıtları. Teknolojisi üniversitelere araştırma için yüksek okullardan değişen kurumlarda kullanım için uyarlanabilir ve ölçeklenebilir. Ayrıca, toplanan görüntülerin görüntü analiz uygulamaları için yeterli kalitede.
Protocol
Representative Results
Discussion
Doğru fenotipik gözlem bir organizma içinde, gen fonksiyonunun anlaşılması belirtileri için çok önemlidir. Fenotipik bilgi elde etmek için bir yolu, yüksek çözünürlüklü görüntü verisi yakalama geçer. Geliştirilen tarayıcı-tabanlı platform birkaç saat üzerinden yüksek çözünürlüklü (4.800 dpi) birçok görüntü koleksiyonu (200 images / tarama periyodu) sağladı. Buna ek olarak, bu platform nedeniyle kolaylıkla ortak bir arayüz 18 kullanılarak farklı tarayıcı binlerce çalıştırmak için birisidir yazılımın esnekliği ve laboratuar sınıf ortamlarda çeşitli şekilde uyarlanmıştır.
Burada sunulan yöntem, büyük ölçekli fenotipleme tesisleri ve tek bir laboratuvarda uygulanabilir otomatik sistemlere kadar uzanan yüksek verimli görüntü yakalama bir boşluğu doldurur. Mevcut yüksek verimli platformlar p yüksek çözünürlüklü görüntü yakalamak için, robotik destekler üzerine monte edilmiş kameralar da dahil olmak üzere özel görüntüleme donanımları, kullanma eğiliminderimarily toprak bitki dokularında (LemnaTec tarafından Bitki Bütünleştirici Teknoloji ve Scanalyzer HTS örneğin Merkezi) 20,21 üstünde. Onlar toprak ortamında (Bitki Bütünleştirici Teknoloji örneğin Merkezi) 11,22,23 büyüdükçe X-ray ve MR teknolojilerini kullanarak özel görüntüleme sistemleri de olağanüstü çözünürlük ile zemin dokuları görüntü aşağıda geliştirilmiştir. Daha özel teknoloji Bu gelişme dinamik fenotip çalışmaları daha zor hale throughput pahasına genellikle. Önemlisi, bu high-end platformları için maliyet ve altyapı ihtiyaçları küçük laboratuarlarda uygulanması için onları çoğunlukla olanaksız hale.
Platformlar da daha fazla standart görüntü yakalama teknoloji kullanımı ve de bu tür bir ağırlık uyarıcıya kök yanıt olarak dinamik yanıtların ölçümü için uygun olan geliştirilmiştir. Örneğin, CCD kameraları, yüksek ışık ve yerçekimine bireysel fide yanıtları yakalamak için kullanılmıştıruzaysal ve zamansal çözünürlük 1,8,12. Diğer sistemler tek bir görüntü (iPlant İşbirlikçi örn RootTipMulti) 17,24 birden köklerinin kök ucu yönelim ölçümüne izin geliştirilmiştir. İlk durumda, verim nispeten düşük ikinci durumda çıkışı daha yüksek iken, sadece bir fide bir anda her kamera tarafından görüntüsü olduğu göz önüne alındığında, ama genellikle çözünürlük pahasına edilir.
Bu yazıda özetlenen prosedür ekipman ve kolayca kullanılabilir ve nispeten uygun fiyatlı yazılımı ile yüksek verim, yüksek çözünürlüklü görüntüler yakalamak için bir platform sunuyor. Bu kurulumu kullanarak, 1.080 bireysel kök reaksiyonları altı tarayıcıların bir banka ile donatılmış tek bir laboratuarda her hafta toplanan olabilir. Haftada 864 bireysel tepkilerin ortalama toplama, 15 ay, 41.625 fidan toplam bir genomik çalışma için tarandı. Bireysel koleksiyonların yaklaşık% 15 nedeni kurulum hatası, netwo başarısızrk hatası veya ekipman arızası. Başka bir% 22 yanıtları bir büyüme tepkisi nedeniyle çimlenme veya yetersiz kök büyüme eksikliği başarısız oldu. Nihai veri seti 163 rekombinant kendilenmiş hatların bir yerçekimi uyarana 27.475 bireysel fide tepkileri artı 99 izogenike yakın çizgiler oluşur. Veriler, bu çok yüksek verimli bir yaklaşım yapma, tek bir laboratuarda toplanmıştır. Hatta edinimi için kullanılan ekipman bile ağır kullanımı ile iki yıldır güvenilir bir işlevi vardır, nispeten ucuz olduğu göz önüne alındığında.
Bu protokol, bu grubun araştırma amaçları için çok yararlı olsa da, yine de bazı sınırlamalar vardır. Çünkü günde sıkıştırılmamış görüntü verisi yaklaşık 50 GB throughput, etkili sıkıştırma programları geliştirilmiştir olabilir sürece alanı büyük miktarda ev görüntüleri için gerekli olduğu belli oldu. Depolama sorunu geçici olarak her bilgisayar için harici sabit diskler satın alarak çözüldü. Buna ek olarak, iki adet 10 TB ağ bağlantılı depolama cihazları satın alındı. Yukarıda açıklandığı gibi, daha sonra, sıkıştırma algoritmaları kadar% 60 (Şekil 8) ile veri boyutunu azaltmaya yardımcı olabilir, geliştirilmiştir. Bu verileri bir ağ bağlantılı depolama aygıtına kaydedilebilir hangi hızda ağ bağlantısının hızına bağlı olduğuna dikkat etmek önemlidir. Sıkıştırma programları nedeniyle de görüntü veri kaybını önlemek için arzu kısıtlı olmuştur.
Bir tarayıcı tabanlı görüntüleme sistemine özgü diğer sınırlamalar da kabul edilmektedir. Örneğin, bir tarayıcı-tabanlı yaklaşım fidanları her tarama sırasında beyaz ve potansiyel kızılötesi aralıkları yüksek şiddette ışığa maruz kalmaktadır. Fideler hala (Şekil 7), bir yerçekimi uyarana sağlam yanıtları geçmesi görülebilir ama bu büyük olasılıkla, fide büyümesini etkiler. Bir gelecekteki gelişim sadece kızılötesi LED aktif böyle tarayıcıları programlama içerebilir. Aktif developmen bir alant de bu görüntü verilerinin çözünürlük ve verimi eşleşen analiz algoritmaları oluşturulmasıdır. Bu tarayıcı-tabanlı bir yöntem kullanılarak oluşturulan büyük veri seti fide görüntüleri yüksek verimlilik fenotipleme için güçlü araçlar gelişimi için ideal olmuştur. Şekil 7'de gösterilen bu görüntüler üzerinde istihdam sıkıştırma algoritması, görüntü analiz uygulamaları için uygun olduğu iddiasını destekler. Ek olarak, üretilen görüntüler daha düşük çözünürlük (en az 1200 dpi) toplanır ise, daha önce yayınlanmış bir algoritma, RootTrace 17,24 ile analiz edilebilir ve fide analizden önce, yukarıda tarif edilen sıkıştırma algoritması kullanılarak resimdeki bölümlenmiştir. Kök büyüme verileri ucu açısı veri 900 dpi (yayınlanmamış gözlem) indirgenmiş görüntüleri elde edilebilir ise 1,200 dpi indirgenmiş görüntüleri elde edilebilir.
Bu yazıda özetlenen prosedür Roo dünyasında kendi niş sığarhala nispeten uygun fiyatlı olurken, yüksek verimlilik ve yüksek çözünürlükte olduğundan t görüntüleme. Bu yaklaşımın bir başka yararı da kolayca belirli bir araştırma grubu görüntüleme ihtiyaçlarını karşılamak için özelleştirilebilir olmasıdır.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (ödül sayısı IOS-1031416) bir hibe ile finanse edildi ve Nathan Miller, Logan Johnson ve Wisconsin Üniversitesi'nden Edgar Spalding ve Brian Bockelman, Carl Lundstedt ve David Swanson ile işbirliği içinde yapılmıştır Nebraska Holland Hesaplama Merkezi Üniversitesi.
Materials
| Epson Perfection V700 Photo Scanners | Epson | B11B178011 | – |
| Plexiglas Scanner Template | – | – | Custom made. See Figure 2. |
| Smart Strap Bungee Cords | SmartStraps | Wal-Mart 1079478 | |
| Brinks Digital Outdoor Timers | Brinks | Wal-Mart 42-1014-2 | |
| VueScan Software | Hamrick Software | http://www.hamrick.com | |
| Segmentation Software | Chris Wentworth, Doane College | https://sites.google.com/a/doane.edu/compphy-doane/projects/root-gravitropism/image-segmentation | |
| 3M Micropore Tape | Fisher Scientific | 19-061-655 | – |
| Holding racks | – | – | Custom made by gluing two cookie racks together. |
References
- Miller, N. D., Brooks, T. L. D., Assadi, A. H., Spalding, E. P. Detection of a gravitropism phenotype in glutamate receptor-like 3.3 mutants of Arabidopsis thaliana using machine vision and computation. 유전학. 186, 585-593 (2010).
- Clack, N. G. Automated Tracking of Whiskers in Videos of Head Fixed Rodents. PLoS Comp. Biol. 8, (2012).
- Lussier, Y. A., Liu, Y. Computational approaches to phenotyping: high-throughput phenomics. Proc. Am. Thoracic Soc. 4, 18-25 (2007).
- Houle, D. Colloquium Paper: Numbering the hairs on our heads: The shared challenge and promise of phenomics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1793-1799 (2009).
- Elwell, A. L., Gronwall, D. S., Miller, N. D., Spalding, E. P., L, T. D. B. Separating parental environment from seed size effects on next generation growth and development in Arabidopsis. Plant Cell Env. 34, 291-301 (2011).
- Silk, W. K. Quantitative Descriptions of Development. Ann. Rev. Plant Physiol. 35, 479-518 (1984).
- Cronin, C. J., Feng, Z., Schafer, W. R. Automated imaging of C. elegans behavior. Methods Mol. Biol. 351, 241-251 (2006).
- Miller, N. D., Parks, B. M., Spalding, E. P. Computer-vision analysis of seedling responses to light and gravity. Plant J. 52, 374-381 (2007).
- Iyer-Pascuzzi, A. S. Imaging and Analysis Platform for Automatic Phenotyping and Trait Ranking of Plant Root Systems. Plant Physiol. 152, 1148-1157 (2010).
- Houle, D., Mezey, J., Galpern, P., Carter, A. Automated measurement of Drosophila wings. BMC Evol. Biol. 3, 25 (2003).
- Jahnke, S. Combined MRI-PET dissects dynamic changes in plant structures and functions. Plant J. 59, 634-644 (2009).
- Durham Brooks, T. L., Miller, N. D., Spalding, E. P. Plasticity of Arabidopsis Root Gravitropism throughout a Multidimensional Condition Space Quantified by Automated Image Analysis. Plant Physiol. 152, 206-216 (2010).
- Perrin, R. M. Gravity signal transduction in primary roots. Ann. Botany. 96, 737-743 (2005).
- Strohm, A. K., Baldwin, K. L., Masson, P. H. Molecular mechanisms of root gravity sensing and signal transduction. Dev. Biol. 1, 276-285 (2012).
- Harrison, B. R., Masson, P. H. ARL2, ARG1 and PIN3 define a gravity signal transduction pathway in root statocytes. Plant J. 53, 380-392 (2007).
- Swarup, R., Bennett, M. J., Beeckman, T. . Root Development. , 157-174 .
- French, A., Ubeda-Tomás, S., Holman, T. J., Bennett, M. J., Pridmore, T. High-throughput quantification of root growth using a novel image-analysis tool. Plant Physiol. 150, 1784-1795 (2009).
- Granier, C. PHENOPSIS, an automated platform for reproducible phenotyping of plant responses to soil water deficit in Arabidopsis thaliana permitted the identification of an accession with low sensitivity to soil water deficit. New Phytol. , 169-623 (2006).
- Walter, A. Dynamics of seedling growth acclimation towards altered light conditions can be quantified via GROWSCREEN: a setup and procedure designed for rapid optical phenotyping of different plant species. New Phytol. 174, 447-455 (2007).
- Gregory, P. J. Non-invasive imaging of roots with high resolution X-ray micro-tomography. Plant Soil. , 255-351 (2003).
- Pierret, A., Kirby, M., Moran, C. Simultaneous X-ray imaging of plant root growth and water uptake in thin-slab systems. Plant Soil. 255, 361-373 (2003).
- Naeem, A., French, A. P., Wells, D. M., Pridmore, T. P. High-throughput feature counting and measurement of roots. Bioinformatics. 27, 1337-1338 (2011).
