El uso de escáneres planos para recopilar de alta resolución de duración transcurrido Imágenes de la gravitrópica Respuesta Arabidopsis Root
Summary
Este protocolo describe un proceso para la toma rápida de imágenes de plantas de semillero de Arabidopsis en respuesta a un estímulo de gravedad, utilizando escáneres planos disponibles en el mercado. El método permite barato, la captura de grandes volúmenes de imágenes de alta resolución susceptibles de algoritmos de análisis de aguas abajo.
Abstract
Los esfuerzos de investigación en biología exigen cada vez más el uso de metodologías que permitan la recolección de grandes volúmenes de datos de alta resolución. Un reto laboratorios pueden enfrentar es el desarrollo y el logro de estos métodos. Observación de los fenotipos en un proceso de interés es un objetivo típico de los laboratorios de investigación que estudian la función del gen y esto se logra a menudo a través de captura de imagen. Un proceso particular que se presta a la observación utilizando enfoques de imagen es el crecimiento correctivo de una raíz de plántulas que se ha desplazado de la alineación con el vector de gravedad. Plataformas de imágenes que se utilizan para medir la respuesta gravitrópica raíz puede ser costoso, relativamente baja en el rendimiento y / o mano de obra. Estas cuestiones se han abordado mediante el desarrollo de un método de captura de imagen de alto rendimiento utilizando todavía en alta resolución, escáneres de bajo costo, de superficie plana. Usando este método, las imágenes se pueden capturar cada pocos minutos a 4800 dpi. La configuración actual permite la recolección de 216 r individuoesponses por día. Los datos de imagen recogidos son de amplia calidad para aplicaciones de análisis de imágenes.
Introduction
Recogida de datos fenotípicos de alta resolución es útil en los estudios que tienen como objetivo comprender la interacción de la genética y el medio ambiente en la mediación del organismo función 1,2. Los estudios de esta naturaleza también son inherentemente de gran escala, por lo que es necesario, además, que los métodos empleados para medir fenotipos en este contexto ser altos en el rendimiento de 3,4. En el establecimiento de métodos para la investigación phenomics escala, intercambios entre la salida y la resolución entran en juego. Métodos que son más altos en el rendimiento también tienden a ser más bajos en la resolución, por lo que es más difícil de detectar pequeños efectos de la genética o el medio ambiente 5. Alternativamente, los métodos que miden más cuidadosamente un fenotipo deseado también tienden a ser menores en el rendimiento, por lo que es difícil para medir los efectos genéticos y ambientales ampliamente. Además, los métodos manuales para la cuantificación de fenotipos, incluyendo inspección visual, pueden estar sujetas a variación debido a las diferencias en los ingresos per humanacepción 6.
Tecnologías de la imagen pueden proporcionar un puente útil entre el rendimiento y la resolución en la obtención de observaciones fenotípicas 7-9. En general, una imagen es relativamente fácil de capturar, facilitando el rendimiento, y cuando se toma en suficiente resolución, fenotipos sutiles se puede detectar 1,2,7. Tecnologías de la imagen tienden a ser modificable para adaptarse a un sistema o proceso de interés y son generalmente escalable 10-12. Debido a esto, las tecnologías de imágenes son ideales para el desarrollo de estudios a gran escala de la función del organismo.
La respuesta de la raíz primaria a un estímulo gravedad es un proceso fisiológico complejo que se produce dentro de un órgano morfológicamente sencilla. La respuesta implica la activación de vías de señalización que se propagan a través del órgano de la raíz y su progresión está determinada por factores genéticos y ambientales, incluyendo factores genéticos influenciados por el ambiente 12-14 </sup>. La respuesta de la raíz primaria a un estímulo gravedad se ha estudiado por lo menos desde Darwin, todavía hay mucho que aprender acerca de cómo funciona, sobre todo en los primeros eventos de señalización y en los factores que median la respuesta plasticidad 12,14,15. Obtener un conocimiento detallado de la dinámica de esta respuesta es importante en la búsqueda de formas de mejorar la capacidad de las plantas de semillero para convertirse exitosamente establecida dentro de un entorno determinado 16. Además, la forma de la raíz hace que sea susceptible para aplicaciones de procesamiento de imágenes 8,12,17. Tomados en conjunto, la respuesta gravitrópica raíz es un sistema ideal para el desarrollo de la tecnología de formación de imágenes de alto rendimiento para el propósito de llevar a cabo estudios de genómica a nivel de la función del organismo.
En este informe se presenta un alto rendimiento, método de alta resolución de captura de imagen de la respuesta gravitrópica raíz utilizando escáneres planos baratos, disponibles en el mercado. La visión general de laprotocolo se muestra en la Figura 1. Las plántulas sembradas en placas de agar se colocaron sobre los escáneres planos orientados verticalmente equipados con los titulares de plexiglás de encargo de la placa. Las imágenes se recogieron cada pocos minutos a 4800 dpi y se guardan en una unidad local o en el servidor de datos. Metadatos asociados con cada serie de imágenes se almacena en una base de datos y las imágenes almacenadas se procesan. El método utiliza el software VueScan para la captura de imágenes. VueScan puede ser utilizado para ejecutar más de 2.100 escáneres diferentes en Windows, Mac, o sistemas operativos Linux (ver Tabla de Materiales). Se utilizó una resolución del escáner de 4800 ppp en esta aplicación para que coincida con la resolución alcanzada en los estudios anteriores utilizando cámaras CCD fijas 1,8,12. La flexibilidad del software VueScan junto con la interfaz común se utiliza para cualquier escáner se ejecuta permite a los usuarios adoptar fácilmente prácticamente cualquier hardware del escáner de suficiente resolución para el protocolo presentado en este documento. Rendimiento actual permite la colección de216 respuestas individuales por día. La tecnología es adaptable y escalable para su uso en las instituciones que van a escuelas preparatorias para investigar universidades. Además, las imágenes recogidas son de calidad suficiente para aplicaciones de análisis de imagen.
Protocol
Representative Results
Discussion
La observación fenotípica exacta es crucial para la comprensión de las manifestaciones de la función de genes dentro de un organismo. Una forma de adquirir información fenotípica es a través de la captura de datos de imagen de alta resolución. La plataforma basada en el escáner desarrollado ha permitido la recolección de muchas imágenes (200 imágenes / período de exploración) en alta resolución (4800 dpi) durante un número de horas. Además, esta plataforma se adapta fácilmente a una variedad de entornos de laboratorio y de la clase debido a la flexibilidad del software VueScan para funcionar miles de diferentes escáneres utilizando una interfaz común 18.
El método que aquí se presenta llena un vacío en el alto rendimiento de captura de imagen que se extiende desde las grandes instalaciones de fenotipado de escala y los sistemas automatizados implementables en un solo laboratorio. Las plataformas de alto rendimiento disponibles en la actualidad tienden a usar el hardware de imágenes especializado, incluyendo cámaras montadas sobre soportes robóticos, para capturar imágenes de alta resolución de primarily arriba tejidos vegetales del suelo (por ejemplo, Centro para la Planta de Tecnología Integrativa y el Scanalyzer HTS por LemnaTec) 20,21. Sistemas de imagen especializados que utilizan tecnologías de resonancia magnética de rayos X y también se han desarrollado para la imagen de abajo tejidos de tierra con notable resolución a medida que crecen en el ambiente del suelo (por ejemplo, el Centro de Tecnología Integrativa Vegetal) 11,22,23. Este desarrollo de la tecnología más especializada es generalmente a costa de rendimiento, por lo que los estudios fenotípicos dinámicos más difícil. Es importante destacar que las necesidades de coste y de infraestructura para estas plataformas de gama alta hacen inviable principalmente para su aplicación en los laboratorios más pequeños.
Plataformas también se han desarrollado, que utilizan la tecnología de captura de imágenes más estándar y son muy adecuadas para la medición de las respuestas dinámicas tales como la respuesta a un estímulo de la raíz de la gravedad. Por ejemplo, las cámaras CCD se han utilizado para capturar las respuestas de plántulas individuales a la luz y la gravedad en alto1,8,12 resolución espacial y temporal. Otros sistemas se han desarrollado lo que permite la medición de la orientación de la punta de la raíz de las múltiples raíces de una sola imagen (por ejemplo RootTipMulti por la iPlant Collaborative) 17,24. En el primer caso, el rendimiento es relativamente bajo dado que sólo una plántula se crea una imagen por cada cámara a la vez, mientras que en el último caso el rendimiento es superior, pero generalmente a costa de la resolución.
El procedimiento descrito en este artículo se presenta una plataforma para la captura de imágenes de alta resolución en un alto rendimiento con equipos y software que son fácilmente disponibles y relativamente asequible. Utilizando esta configuración, 1.080 respuestas individuales de raíz se pueden recoger cada semana en un único laboratorio equipado con una batería de seis escáneres. En 15 meses de recogida de un promedio de 864 respuestas individuales a la semana, un total de 41.625 plantas de semillero se analizan en busca de un estudio de la genómica. Alrededor del 15% de las colecciones individuales falló debido a un error de configuración, Nefracaso rk o mal funcionamiento del equipo. Otro 22% de respuestas fracasaron debido a la falta de germinación o crecimiento de las raíces insuficiente para provocar una respuesta de crecimiento. El último conjunto de datos consta de 27.475 respuestas de plántulas individuales a un estímulo gravedad desde 163 líneas endogámicas recombinantes, además de 99 líneas casi isogénicas. Los datos fueron recogidos en un solo laboratorio, haciendo de este un enfoque de muy alto rendimiento. Incluso teniendo en cuenta que los equipos utilizados para la adquisición es relativamente barato, que ha funcionado de forma fiable durante más de dos años, incluso con un uso intensivo.
Aunque este protocolo ha sido muy útil para los objetivos de investigación de este grupo, todavía existen algunas limitaciones. Debido a el rendimiento de alrededor de 50 GB de datos de imagen sin comprimir por día, era evidente que se necesita una gran cantidad de espacio a las imágenes de la casa a menos esquemas de compresión eficaces podrían desarrollarse. El problema de almacenamiento se resolvió temporalmente mediante la compra de discos duros externos para cada equipo. Además, dos 1Red 0 TB dispositivos de almacenamiento asociados fueron adquiridos. Más tarde, se desarrollaron algoritmos de compresión, como se describió anteriormente, que puede ayudar a reducir el tamaño de los datos hasta en un 60% (Figura 8). Es importante señalar que la velocidad a la cual los datos pueden ser guardados en un dispositivo de almacenamiento asociado red depende de la velocidad de la conexión de red. Esquemas de compresión también se han visto limitadas por el deseo de evitar la pérdida de datos de imagen.
También se están considerando otras limitaciones propias de un sistema de imagen basado en el escáner. Por ejemplo, en un enfoque basado en el escáner de plántulas están expuestos a luz de alta intensidad en los rangos blanco y potencialmente infrarrojos durante cada exploración. Esto probablemente afecta el crecimiento de las plántulas, aunque las plántulas todavía se pueden observar a someterse respuestas sólidas a un estímulo gravedad (Figura 7). Una mejora en el futuro podría incluir la programación de este tipo de escáneres que sólo LEDs infrarrojos están activos. Un área en la developmen activot es la creación de algoritmos de análisis y de concordancia con la resolución y el rendimiento de estos datos de la imagen. El gran conjunto de datos generados con este método basado en el escáner ha sido ideal para el desarrollo de herramientas robustas para el alto rendimiento fenotipificación de las imágenes de plántulas. El algoritmo de compresión empleado en estas imágenes que se muestran en la Figura 7 es compatible con la afirmación de que son susceptibles a aplicaciones de análisis de imagen. Además, las imágenes generadas pueden ser analizados por el algoritmo previamente publicado, RootTrace 17,24, si se recogen en una resolución más baja (menos de 1.200 dpi), y las plantas de semillero individuales se dividen en segmentos de la imagen utilizando el algoritmo de compresión descrito anteriormente antes del análisis. Datos de crecimiento de las raíces podrían ser extraídos de las imágenes reducidas a 1200 dpi, mientras que los datos del ángulo de punta podrían extraerse de las imágenes reducidas a 900 dpi (observación no publicada).
El procedimiento descrito en este documento se inscribe en su propio nicho en el mundo de la root de imágenes, ya que es de alto rendimiento y alta resolución sin dejar de ser relativamente asequible. Una ventaja adicional de este método es que puede ser fácilmente modificado para requisitos particulares para adaptarse a las necesidades de imagen de un grupo de investigación en particular.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por una beca de la National Science Foundation (adjudicación número IOS-1031416) y ha sido realizado en colaboración con Nathan Miller, Logan Johnson y Edgar Spalding, de la Universidad de Wisconsin y Brian Bockelman, Carl Lundstedt y David Swanson, de la Universidad de Holanda Computing Center de Nebraska.
Materials
| Epson Perfection V700 Photo Scanners | Epson | B11B178011 | – |
| Plexiglas Scanner Template | – | – | Custom made. See Figure 2. |
| Smart Strap Bungee Cords | SmartStraps | Wal-Mart 1079478 | |
| Brinks Digital Outdoor Timers | Brinks | Wal-Mart 42-1014-2 | |
| VueScan Software | Hamrick Software | http://www.hamrick.com | |
| Segmentation Software | Chris Wentworth, Doane College | https://sites.google.com/a/doane.edu/compphy-doane/projects/root-gravitropism/image-segmentation | |
| 3M Micropore Tape | Fisher Scientific | 19-061-655 | – |
| Holding racks | – | – | Custom made by gluing two cookie racks together. |
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