على الفئران نموذج مثلي من سرطان البروستاتا البشرية الانبثاث
Summary
هذا النموذج مثلي من سرطان البروستاتا البشرية يسمح للالكمي لحجم الورم، وتعميم الخلايا السرطانية، وتشكيل ورم خبيث متميزة إلى الرئة. كما يجب أن الهروب خلايا الجهاز الرئيسي، تدخل مجرى الدم، وزرع في موقع ثانوي، وهذا النموذج يلخص بشكل فعال السيناريو في البشر.
Abstract
وقد وضعت لدينا مختبر نموذج زرع مثلي الرواية من سرطان البروستاتا البشرية (PCA). كالموت PCA ليس بسبب الورم الرئيسي، وإنما تشكيل ورم خبيث متميزة، والقدرة على تصميم نموذج فعال هذا التقدم قبل سريريا ذات قيمة عالية. في هذا النموذج، يتم زرع الخلايا مباشرة في الفص البطني من البروستاتا في BALB / ج athymic الفئران، وسمحت للتقدم لمدة 4-6 أسابيع. في إنهاء التجربة، العديد من نقاط النهاية متميزة يمكن قياسها، مثل حجم والتوصيف الجزيئي للورم الأولية، فإن وجود وتقدير من الخلايا السرطانية المنتشرة في الدم ونخاع العظام، وتكوين ورم خبيث في الرئة. بالإضافة إلى مجموعة متنوعة من النتائج النهائية، ويقدم هذا النموذج صورة لقدرة الخلايا على غزو والهروب من الجهاز الرئيسي، أدخل والبقاء على قيد الحياة في الدورة الدموية، وزرع وتنمو في موقع ثانوي. وقد استخدم هذا النموذج على نحو فعال لقياس النقيليردا على كل من التغيرات في تعبير البروتين وكذلك استجابة لعلاجات جزيء صغير، في فترة زمنية قصيرة.
Introduction
سرطان البروستاتا (PCA) هو السرطان الأكثر تشخيصا لدى الرجال، والسبب الرئيسي الثاني للوفاة بالسرطان في الولايات المتحدة 1. الموت من PCA لا يعود إلى تشكيل الورم الرئيسي، وإنما تشكيل ورم خبيث. وبالتالي، والوقاية من ورم خبيث في المرضى له أهمية كبيرة. نماذج الماوس من PCA تقديم تنوع من الخيارات للكشف عن المعلومات البيولوجية الهامة حول هذا المرض.
مجموعة متنوعة من نماذج الماوس من PCA موجودة، ولكل منها مزايا والقصور الكامنة. في حين تردد في البشر PCA عالية، طبيعيا PCA غير شائع للغاية في الفئران 2، على الرغم من قابلية متساوية من الفئران الشاملة لمرض السرطان 3. استثناء واحد القوارض هو تطوير الشراكة والتعاون في الفئران Lobund ويستار، والتي يمكن أن تحقق معدلات PCA من 90٪ لمدة 12 شهرا من العمر عن طريق تحريض methylnitrosourea والتستوستيرون 4. لهذا السبب، بفعل أنظمة النموذج، مثل TRAMPوتستخدم (غدية المعدلة وراثيا من الفأرة البروستاتا) نموذج شائع. يمكن للنموذج TRAMP لحث على التعبير التحوير وتحديدا في البروستاتا، ويخضع لتطور طبيعي لمحكمة التحكيم الدائمة، من تضخم البروستاتا ل[إينتربيثليل (PIN) إلى اللمفاوية وورم خبيث الرئوي 5-6. هذه النماذج توفير فوائد أن تكون قادرة على قياس مجموعة كاملة من تطور الورم، وكذلك تحتوي على جهاز المناعة سليما. ومع ذلك، يمكن للأحداث الجزيئية الكامنة وراء تطوير PCA تختلف بين الفئران والبشر، ولقد أظهرت الارتباطات بين الفئران والدراسات السريرية الإنسان تقلب. بالإضافة إلى ذلك، كل من هذه النماذج هي مضيعة للوقت، على سبيل المثال يتطلب نموذج TRAMP حوالي 28 أسبوعا من أجل تطوير الانبثاث.
في دراسة ورم خبيث، ويستخدم في كثير من الأحيان الذيل الوريد أو الأيسر البطين النموذجية الحقن. هذا النموذج يستفيد من فترة زمنية سريعة، وبالإضافة إلى ذلك يمكن قياس وجود metastas العظامهو استخدام خطوط الخلايا المحددة والظروف. وأفادت يانغ وآخرون أن الحقن تحت الجلد من خلايا PC3-GFP إيجابية يمكن أن يسبب نطاق واسع الانبثاث العظام 7، والذيل الوريد وحقن intercardiac قد ولدت أيضا الانبثاث العظام التنمية 8-9. القيود الرئيسية من هذه النماذج تتصل عدم وجود الورم الرئيسي المقيمين داخل غدة البروستاتا نفسها. أبعد من ذلك، لنماذج تعتمد على حقن الخلايا السرطانية في الدورة الدموية، وهذا يتجاوز النصف الأول بأكمله من تتالي النقيلي. فإنه بذلك يحول دون النظر في الخطوات الأولية، بما في ذلك الغزو من خلال الجهاز الرئيسي، والتي هي بيولوجيا تدابير حاسمة من التحول النقيلي. العديد من المنظمين التحول النقيلي تؤثر بشكل مباشر على غزو الخلايا في وقت مبكر. خطوات مبكرة في تتالي النقيلي تشكل المواقع ذات الأولوية العالية لاستهداف العلاجية، ومرة واحدة الخلايا السرطانية نشر، ويوسع الاختلاف نسيلي إلى حد كبير، وبالتالي زيادة البيولوجيةتنوع القاعدة وتناقص استهداف علاجية فعالة.
في محاولة للرد على العديد من القيود المفروضة على هذه النماذج، وقد وضعت مختبرنا نموذج مثلي من PCA الإنسان الذي هو مزروع خط الخلية PCA PC3-M الإنسان مباشرة في البروستاتا من BALB / ج athymic الفئران. بعد 4-6 أسابيع، وحجم الورم، وجود الخلايا السرطانية المنتشرة (التدرجي)، والانبثاث إلى الرئتين والغدد الليمفاوية يمكن أن يكون كميا فقط. وقد استخدمنا هذا النموذج فعال لتقييم فعالية 4 '،5،7-trihydroxyisoflavone (الجينيستين) لمنع الإنسان PCA الانبثاث 10. وقد تم ربط الاستهلاك الغذائي من الجينيستين إلى انخفاض في البروستاتا ورم خبيث من السرطان والموت 11-12، ولكن في السابق أي دراسة قد يحدد ما إذا بالإدارة من الجينيستين يمكن أن يغير PCA الانبثاث في الحيوانات أو الرجال. في هذه الدراسة أثبتنا أن العلاج مع الجينيستين انخفاض كبير في عدد من ورم خبيث في الرئة. بالإضافة إلى ذلك، نحن مصممون الجينيستين آلtered تفعيل والتعبير عن العديد من البروتينات المؤيدة للالمنتشر هاما في الورم الرئيسي، بما في ذلك التنسيق كيناز التصاق (FAK)، P38-mitogen تنشيط بروتين كيناز (P38 MAPK)، والحرارة صدمة بروتين 27 (HSP27).
يتفق مع نتائج هذه الملاحظات في العيادة. باستخدام الدم تم الحصول عليها من الفئران، كنا قادرين على قياس دقيق لتركيزات الدم من الجينيستين، ولاحظ هذه لتكون مماثلة لمستويات في البشر مع الاستهلاك الغذائي العادي للالجينيستين. بالإضافة إلى ذلك، دراسة المرحلة الثانية التي يقوم بها مجموعتنا قررت أن على العلاج مع الجينيستين، والرجال من ذوي الخبرة انخفاض في البروستاتا مرنا الأنسجة التعبير عن الجينات المرتبطة غزو الخلوية وورم خبيث، وتحديدا نوع مصفوفة الفلزي 2 (MMP-2) 13.
وقد استخدمنا أيضا هذا النموذج لتقييم تأثير تغير التعبير الجيني المنتج في الورم الرئيسي على الإنسان PCA الانبثاث 14. وsuppr الورمESSOR endoglin هو عضو في الفصيلة TGFβ ويقمع الغزو PCA الإنسان الخلوية في المختبر عن طريق تغيير صماد يشير 15. نحن تمديد هذه الدراسات لتحديد تأثير الإنسان على endoglin الانبثاث محكمة التحكيم الدائمة. تم زرع مستقرة ضربة قاضية endoglin، مكافحة ناقلات الأمراض أو endoglin على خطوط الخلايا التعبير في الفئران. أظهرت Endoglin خلايا ضربة قاضية على أعلى عدد من الانبثاث الرئة، وكذلك التدرجي في 38٪ من الفئران. وأظهرت الفئران مزروع مع مكافحة النواقل استجابة متوسطة، مع أقل الانبثاث الرئة في الماوس، والتدرجي في 18٪ فقط من الفئران. وأظهرت الفئران عالية endoglin مزروع قمع كاملة تقريبا من ورم خبيث في الرئة، وقمع كاملة من التدرجي.
هذه ليست سوى مثالين من مجموعة واسعة من تطبيقات هذه التقنية لديها. من اكتشاف المخدرات، إلى التغييرات النمذجة في البيولوجيا الجزيئية، وهذا النموذج يقدم طريقة إنتاجية عالية لتقييم آثار وظائف مختلفة على نمو الورم والخلدالتغييرات cular، ووجود التدرجي، وتشكيل ورم خبيث في الرئة متميزة والغدد الليمفاوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الورقة نقدم نموذجا الفئران رواية الإنسان الانبثاث محكمة التحكيم الدائمة. في هذا النموذج، يتم زرع الإنسان PCA خطوط الخلايا PC3-M orthotopically مباشرة في البروستاتا من BALB / ج athymic الفئران والأورام يسمح لتطوير لمدة 4-6 أسابيع. في المقطع نتائج ممثل، وتبين لنا أمثلة من البيانات التي يمكن جمعها، بما في ذلك وزن الماوس والاستهلاك الغذائي، حجم الورم والوزن، والخصائص الجزيئية للورم، وتشكيل ورم خبيث متميزة إلى الرئة. بالإضافة إلى ذلك، مجموعة متنوعة واسعة من نواتج إضافية يمكن دراستها اعتمادا على الاهتمامات البحثية معينة. أحد الأمثلة على ذلك هو وجود التدرجي إلى الدم ونخاع العظام. كما التدرجي هي الحدث نادرة نسبيا (نلاحظ التدرجي في حوالي 5-20٪ من الحيوانات السيطرة)، كنا لا يستغرب أن أيا من الفئران خمسة في هذه التجارب المتقدمة التدرجي. وقد استخدمت لدينا مختبر أيضا هذا النموذج لتحديد التغييرات في التصاق الخلوية عن طريق قياس مورفولوجيا الخلايا النووية فيالبروستاتا الأنسجة 10. علينا أيضا أن تستخدم هذا النموذج لتقييم انتشار الورم والخلايا الأولية باستخدام الوضع Ki67 والنفق تلطيخ للورم البروستاتا 14.
بالإضافة إلى تشكيلة واسعة من نواتج البيانات التي يمكن الحصول عليها، ويمكن استخدام هذا النموذج لتحديد الآثار المترتبة على كلا من التغيرات في تعبير البروتين وكذلك العلاجات جزيء صغير. بالمقارنة مع العديد من الموديلات العفوية والتي يسببها الإنسان من ورم خبيث PCA، وهناك فترة زمنية أكبر من 4-6 أسابيع فقط. نماذج أخرى مع تحديد فترة زمنية عالية، مثل الوريد الذيل أو نماذج حقن intercardiac، يكون لها حدود لا الورم الرئيسي، وبالتالي لا تلخص تماما العيادة تتالي النقيلي. في نموذجنا، يجب أن الخلايا السرطانية الهروب من الموقع الأساسي المنشأ، أدخل والبقاء على قيد الحياة الدورة الدموية، وزرع في موقع ثانوي. وهذا يوفر خطوات إضافية في أي تدخل علاجي أو تغيير في تعبير البروتين يمكن أن تقدم لها تأثير. عديtionally، ينبغي وجود الورم الرئيسي سماح لتطبيق سهلة من هذا النموذج لتقنيات التصوير الجديدة مثل القائم على luciferase المراسل IVIS 16-17.
على الرغم من مجموعة واسعة من الفوائد لهذا النموذج، وهناك أيضا العديد من القيود للنظر فيها. عدد متزايد من الدراسات تظهر أهمية جهاز المناعة في المكروية الورم ونمو الانبثاث 18. في هذا النموذج، وذلك بسبب استخدام حيوان قارض athymic، والقدرة على تقييم آثار نظام المناعة غير ممكن. والقيد الثاني هو عدم وجود استجابة الاندروجين في خلايا PC3-M. بناء على التشخيص الأولي لمحكمة التحكيم الدائمة، والمرضى في كثير من الأحيان سيخضع العلاج الاندروجين كعلاج الخط الأول. ومع ذلك، سوف تصبح في نهاية المطاف سوف تبدأ المرضى مقاومة للالاندروجين والأورام في النمو مرة أخرى. كما تفتقر خلايا PC3-M مستقبلات الاندروجين، وهذا النموذج يقيس فقط آثار العلاج من تعاطي المخدرات أو البروتين التشكيل على بعد الاندروجين ج مقاومةANCER. وإن كان هذا هو وجود قيود، الاندروجين استجابة PCA حاليا التعامل بشكل جيد ولديه مجموعة متنوعة من خيارات العلاج الفعال، وأصبحت بالتالي مقاومة السرطان الاندروجين أكثر بروزا دراستها. كما يستخدم هذا النموذج تحديدا سلالة من الفئران الفطرية، مما يقلل الماوس لتقلب الماوس. ومع ذلك، قد تكون هذه السلالة تستجيب بشكل خاص لبروتينات معينة أو جزيئات صغيرة، وبالتالي ينبغي الحرص عند استقراء هذه البيانات الى العيادة.
على الرغم من هذا النموذج يوفر القياس الفعال للنجاعة الأدوية في وقت التحول السريع من 4-6 أسابيع، وهذا قد لا تأخذ في الاعتبار آثار المخدرات الجرعات طويلة الأجل. بعد التعرض لفترة طويلة لكثير من العلاجات المتاحة حاليا، والمرضى قد تعود مع السرطان المقاوم للأدوية سنوات عديدة بعد العلاج. التحول السريع من هذه التقنية لا تسمح لنمذجة الفعال لقدرة الورم لتصبح مقاومة للعلاج. ولكن، مع هذا التشكيل السابقperiment، وخلايا سرطان البروستاتا البشرية مقاومة للعلاج يمكن زرعها، وفعالية علاجية من الجيل الثاني في منع PCA نمو الورم والانبثاث يمكن أن تكون على غرار. بالإضافة إلى ذلك، إذا كان يحاول مجموعة لدراسة التغيرات الجزيئية في الورم الرئيسي مع مرور الوقت، وهذا نموذج على المدى الطويل مثل نموذج TRAMP من المرجح أن تكون أكثر فعالية لتلك الدراسات.
قيود أخرى من هذا النموذج هو نشر الانبثاث متميزة فقط إلى الغدد الليمفاوية والرئتين من الحيوانات. كل من هذه المواقع هي مواقع متكررة وذات الصلة سريريا من ورم خبيث، كما يتضح من دراسات تشريح الجثة دافئة الإنسان 19. ومع ذلك، سريريا الانبثاث العظام يشكل سمة بارزة من سمات PCA الإنسان، وبالتالي تلخص هذه النماذج هي التي تهم. للأسف، وهذه هي من الصعب أن ألخص في نموذج الفأر، مع عدد قليل جدا من النماذج التي تبين الانبثاث العظام دون الوريد الذيل، وحقن intercardial، أو زرع المباشر فيحتى العظم 20. وبالتالي إذا استهدفت حتى العظم هو من أهمية التجريبية الرئيسية، قد يكون نموذج آخر أكثر فعالية. ومع ذلك، وهذا النموذج لا توفر قدرا من حركة المرور حتى العظم في شكل نخاع العظم الخلايا السرطانية المنتشرة.
على الرغم من هذه القيود، وهذا الأسلوب هو نموذج قوي من PCA الإنسان. القدرة على قياس التأثيرات على كل من الورم الرئيسي وكذلك تشكيل المنتشر في فترة زمنية قصيرة يوفر تشكيلة واسعة من التطبيقات. في هذا النموذج، يجب الهروب خلايا الجهاز الرئيسي، أدخل والبقاء على قيد الحياة في مجرى الدم، وزرع في موقع ثانوي، تلخص هذه العملية في البشر. قياس إضافية من الخصائص الجزيئية للورم الابتدائي، التغييرات في مورفولوجية الخلية، وجود الخلايا السرطانية المنتشرة يوفر نفسا واسعة من المعلومات من نموذج واحد. ويمكن استخدام هذا الإجراء على حد سواء في سياق اكتشاف المخدرات وكذلك لدراسة التغيرات في البيولوجيا الورم.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) إلى RCB، CA122985 والبروستاتا SPORE CA90386، وأحزاب اللقاء المشترك، NIH T32 AG000260 "اكتشاف المخدرات التدريب في اضطرابات العمر المتصلة"، والتي كتبها والتر S. ووسيين برنامج الدراسات العليا في علوم الحياة Driskill في جامعة نورث وسترن. نود أيضا أن نشكر ماوس Phenotyping ومختبر علم الأنسجة وعلم الأمراض مرفق الأساسية في جامعة نورث وسترن.
Materials
| Equipment | |||
| 1 ml Syringe, Tuberculin, Slip-Tip | Becton Dickinson | 309659 | |
| 23 G 3/4 Precison Glide Needle | Becton Dickinson | 305143 | |
| 30 G 1/2 Precision Glide Needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| Alcohol Wipes | Triad | 10-3001 | |
| Autoclip Applier, 9mm, Stainless Steel | Becton Dickinson | 427630 | |
| Clips, 9mm | VWR | 15431-673 | |
| Convertors Polyline Towel (Sterile) | Cardinal Health | 3520 | |
| Cotton-Tipped Applicators, 6 inch, Sterile, Wooden Shaft | Fisher | 23-400-125 | |
| Curad Sterile Cotton Balls | VWR | 500043-544 | |
| Derf Needle Holder, Integra Miltex, 121 mm (4 3/4″) | VWR | 95039-192 | |
| Duraprene SMT Sterile Neoprene Powder-Free Surgical Gloves | Cardinal Health | 2D72PN70 | |
| Germinator 500 | Cell Point Scientific | SN 7030 | |
| Kendall Monojet Needles, 1/2 cc syringe with permanent 28 G 1/2 needle | Tyco | 1180528012 | |
| Medium Heating Pad | VWR | 100229-094 | |
| Merit Iris Scissors, Sklar, 11.4 cm (4 1/2″) | VWR | 94000-000 | |
| Metric/English Vernier Caliper | VWR | 19155-057 | |
| PDS*11 Violet Monofilament Sutcher 4-0, 27″ | Ethicon | Z304H | |
| VetEquip Inhalation Anesthesia System | Contact Your Animal Facility for Availability | ||
| VWR Premium Tissue Cassettes | VWR | 18000-010 | |
| VWR Specimen Forceps, Serrated, Straight, 114 mm (4 1/2″) | VWR | 82027-440 | |
| Reagents | |||
| Betadine Surgical Scrub | Fisher Healthcare | 19-027132 | |
| Buprenex | Controlled Substance – Obtain from Animal Facility | ||
| Dako DAB + Chromagen | Dako | K3468 | |
| Dako Envision + System HRP-Labeled Polymer, Anti-Rabbit | Dako | K4003 | |
| Dako Envision Kit Protein Block | Dako | X0909 | |
| Formalin | VWR | 95042-908 | |
| GFP Antibody | Invitrogen | A11122 | |
| Hematoxylin | Mayer | MH580-2.5L | |
| Meloxican | Obtain from Animal Facility | ||
| Nembutal | Controlled Substance – Obtain from Animal Facility | ||
| Rneasy RNA Isolation Kit | Qiagen | 74104 | |
| Sterile Saline | Obtain from Animal Facility | ||
| Taqman Reverse Transcription Reagents | Life Technologies | N8080234 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4304437 | |
| Trizol | Invitrogen | 10296 |
References
- Jemal, A., et al. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin. 61, 69-90 (2011).
- Shappell, S. B., et al. Prostate pathology of genetically engineered mice: definitions and classification. The consensus report from the Bar Harbor meeting of the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee. Cancer Res. 64, 2270-2305 (2004).
- Rangarajan, A., Weinberg, R. A. Opinion: Comparative biology of mouse versus human cells: modelling human cancer in mice. Nat. Rev. Cancer. 3, 952-959 (2003).
- Pollard, M. Lobund-Wistar rat model of prostate cancer in man. Prostate. 37, 1-4 (1998).
- Gingrich, J. R., et al. Androgen-independent prostate cancer progression in the TRAMP model. Cancer Res. 57, 4687-4691 (1997).
- Gingrich, J. R., et al. Metastatic prostate cancer in a transgenic mouse. Cancer Res. 56, 4096-4102 (1996).
- Yang, M., et al. A fluorescent orthotopic bone metastasis model of human prostate cancer. Cancer Res. 59, 781-786 (1999).
- Wu, T. T., et al. Establishing human prostate cancer cell xenografts in bone: induction of osteoblastic reaction by prostate-specific antigen-producing tumors in athymic and SCID/bg mice using LNCaP and lineage-derived metastatic sublines. Int. J. Cancer. 77, 887-894 (1998).
- Dolman, C. S., et al. Suppression of human prostate carcinoma metastases in severe combined immunodeficient mice by interleukin 2 immunocytokine therapy. Clin. Cancer Res. 4, 2551-2557 (1998).
- Lakshman, M., et al. Dietary genistein inhibits metastasis of human prostate cancer in mice. Cancer Res. 68, 2024-2032 (2008).
- Messina, M. J., Persky, V., Setchell, K. D., Barnes, S. Soy intake and cancer risk: a review of the in vitro and in vivo data. Nutr. Cancer. 21, 113-131 (1080).
- Adlercreutz, H., Markkanen, H., Watanabe, S. Plasma concentrations of phyto-oestrogens in Japanese men. Lancet. 342, 1209-1210 (1993).
- Xu, L., et al. MEK4 function, genistein treatment, and invasion of human prostate cancer cells. J. Natl. Cancer Inst. 101, 1141-1155 (2009).
- Lakshman, M., et al. Endoglin suppresses human prostate cancer metastasis. Clin. Exp. Metastasis. 28, 39-53 (2011).
- Craft, C. S., Romero, D., Vary, C. P., Bergan, R. C. Endoglin inhibits prostate cancer motility via activation of the ALK2-Smad1 pathway. Oncogene. 26, 7240-7250 (2007).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J. Vis. Exp. , e1210 (2009).
- Cordero, A. B., Kwon, Y., Hua, X., Godwin, A. K. In vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer. J. Vis. Exp. , e2125 (2010).
- Buijs, J. T., vander Pluijm, G. Osteotropic cancers: from primary tumor to bone. Cancer Lett. 273, 177-193 (2009).
- Rubin, M. A., et al. Rapid (“warm”) autopsy study for procurement of metastatic prostate cancer. Clin. Cancer Res. 6, 1038-1045 (2000).
- Singh, A. S., Figg, W. D. In vivo models of prostate cancer metastasis to bone. J. Urol. 174, 820-826 (2005).
