마우스에서 비디오 분석 시스템을 사용하여 콘텐츠 및 시작됨 공포 컨디셔닝 테스트

실험은 모두 로컬 동물 보호 및 사용위원회가 정한 지침 및 프로토콜에 따라 수행되어야한다. 1. 장치 설정 에어컨 및 상황에 맞는 테스트를위한 장치의 대전 그리드 바닥의 사각 챔버, 음원 및 교정 충격 생성기입니다. 다양한 챔버의 크기는 치수 X 27cm X 30cm 21-25센티미터가 X 35cm X 30cm 22 54cm의 변화와 함께 사용된다. 덮여 금속 격자와 (0.2 cm 직경 0.5 cm 이격)이 프로토콜에서, 상기 장치는 (측벽에 백색;, 투명한 전면 및 후면 벽에서 33cm가 X X 28cm 25cm가) 아크릴 사각 챔버로 구성 투명 아크릴 뚜껑 (그림 1A)에 의해. 또한, 블랙 아구 티 또는 희석 갈색 생쥐의 거동을 분석하는 백색 아크릴 층 (도 1b)에 챔버를 배치 할 필요가 있기 때문에 I와 화상 분석 시스템(무료로 다운로드 할 수 있습니다, 재료 / 시약의 표 참조) mageFZ 소프트웨어 프로그램은 각 캡처 한 비디오 이미지의 흰색 배경에서 어두운 피사체를 구별한다. 흰둥이 마우스는 검은 금속 격자와 검은 색 아크릴 바닥 (그림 1B)를 사용하여 테스트 할 수 있습니다. 발광 다이오드 (LED) 조명이 장치 위의 천장에 부착된다. 그리드 층은 LED 조명 100 럭스 조명된다. 백색 잡음 / 톤 제너레이터 (그림 1C)에 연결된 스피커가 5cm 조건 자극 (CS)로 청각 신호 (백색 소음, 55dB)를 제시하는 뚜껑 위의 천장에 장착된다. 그리드는 무조건 자극 (미국)로 전기 footshock을 제공하는 충격 발생기 (그림 1C)에 연결됩니다. 시험 챔버는 시험 중에 외부 소음을 최소화하기 위해 방음 실 (170cm X 210cm X 200cm) (그림 1D)에 배치됩니다. 이 조건은 현재 대상이되지 않는 쥐를 방지청각 신호 또는 시험 마우스의 발성 청력 테스트합니다. 큐 시험 장치는 새로운 콘텍스트를 제공 조절 챔버에서 상이한 특성을 보유 챔버로 구성된다. 이것은 마우스가 조절 실 무관 것으로 신규 한 컨텍스트를 인식하도록 극력 감각 신호를 변경하는 것이 필수적이다. 일반적으로, 다른 상자 모양 또는 삼각형의 실이 사용됩니다. 또, 다른 조명 및 / 또는 후각 큐들은 또한 마우스에 제공된다. 이 프로토콜에서, 장치는 아크릴 삼각형 실이다 (33cm X X 32cm 29cm, 양쪽 벽에 흰색) 흰둥이를위한, 검은 아구 티, 또는 희석 갈색 쥐 또는 평면, 블랙 층의 평면, 흰색 바닥 마우스, 투명 아크릴 뚜껑 (그림 1E)으로 덮여있다. LED 조명은 장치 위의 천장에 부착된다. 바닥의​​ 조도는 30 럭스로 설정된다. 스피커는 5cm 홍보하는 뚜껑 위의 천장에 설치냉방시 마우스에 제공된 것과 동일하다 청각 신호를 ESENT. 삼각형 챔버는 에어컨 및 상황에 맞는 테스트가 수행되는 방에서 다른 방음 방에 있습니다. 각 챔버는 쿼드 비디오 스플리터와 USB 마우스의 행동을 모니터링하는 촬상 장치, 및 장치 및 마우스의 이미지를 통해 Windows 컴퓨터에 연결 천장 마운트 전하 결합 소자 (CCD) 카메라를 탑재는에 의해 캡쳐 및 분석 어플리케이션 소프트웨어 프로그램은 ImageFZ (프로토콜 6 참조). 백색 잡음 및 footshock 발생기는 자동 ImageFZ 소프트웨어 프로그램에 의해 제어되며, 시작 시간 및 백색 잡음 및 footshock의 기간에 대한 비디오에 도시 샘플 텍스트 파일 '단순 COND'를 참조 (텍스트 파일에 기록되어야한다 응용 프로그램에 읽기 매개 변수가 파일에 기록하는 방법에 대한 자세한 내용). 각각의 테스트는, 아크릴 벽에 시작하기 전에과 바닥은 슈퍼 차아 물 (산도 6-7)에 적신 수건으로 닦아하고, 그리드는 후각 신호에 따라 편견을 방지하기 위해 70 % 에탄올로 청소. 그리드는 그리드 인해 녹에 자신의 전기 전도성을 감소하지 않도록 에탄올 대신 슈퍼 차아 물을 닦아됩니다. 2. 동물 준비 일반적으로 2-4 마우스는 12 시간 빛 / 어둠주기 (예 : 오전 7:00에 점등)와 온도 제어 보류 실 (23 ± 2 ° C)에서 케이지 당 수용된다. 이 프로토콜에서, 행동에 케이지 운송 가능한 영향을 줄이기 위해 실험 환경에 쥐를 적응하기 위해, 마우스가 포함 된 케이지는 방음 테스트 룸에서 적어도 30 분에 인접한 방음 대기실에 동물 보관실에서 전송 각 테스트가 시작되기 전에. 실험 (도 2A)는 모두 해제 동안 수행되어야다른 시간 23,24에서 테스트하여 제조 행동 변화를 최소화하기 밝거나 어두운 위상 AME 기간 매일. 이 프로토콜에서 모든 실험은 (빛 단계에서 오전 8시부터 오후 6시까지) 어두운 단계의 시작하기 전에 가벼운 상과 1 시간의 개시 후 1 시간 사이에 실시됩니다. 단지 하나의 장치를 사용할 수있는 경우, 각각의 유전자형 생쥐는 실험 시간 및 동작 성능에 대한 피험자의 시험 순서의 잠재적 인 영향을 감소시키는 카운터 위해 테스트되어야한다. ImageFZ 4 장치의 최대를 제어 할 수 있습니다. 카운터 위해 4 장치를 사용하여 동시에 4 쥐를 테스트하는 것은 연구자가 시간을 절약 할 수 있으며 마우스 동작에 대한 실험 매개 변수의 가능한 효과를 감소시킨다. 3. 조절 마우스는 조절 챔버에 배치되며, 마우스는 일반적으로 자유롭게 120 초 동안 챔버를 탐색 할 수있다. 그 후, AU이러한 화이트 노이즈, 톤, 청각 리모콘으로 ditory 큐는 30 초 동안 CS로 제시하고, 0.1 ~ 0.8 mA의 footshock는 소리의 마지막 2 초 동안 미국과 마우스에 제공됩니다. CS-US 껍질을 벗기고의 프레 젠 테이션의 연결을 강화하기 위해 반복된다. 생쥐는 상기 챔버의 컨텍스트 및 혐오 경험 간의 연결을 설정하는 최종 프레젠테이션 후 시간의 기간 동안 챔버 내에 남아있다. 이 프로토콜에서 무료 탐사의 120 초 후, 청각 신호 (백색 소음, 55dB)을 30 초 동안 제시하고, 0.3 mA의 footshock는 백색 잡음의 마지막 2 초 동안 지속적으로 전달됩니다. 90 초 후, footshock와 청각 신호의 페어링은 다시 주제로 주어진다. CS-US의 프리젠 테이션 (그림 2B) (조화의 시작 후 120, 240, 360 초) 세 세션 당 시간을 반복합니다. 최종 footshock 다음, 마우스는 90 초 동안 챔버에 그대로 남아 있습니다. 에어컨 세션이 시작하기 전에, 플러그인 메뉴 'FZ 컨디셔닝 및 FZ 온라인 (4 실)'를 선택 ImageFZ 응용 소프트웨어 프로그램을 실행하고, 단계별로 다음과 같이 매개 변수 값을 설정합니다. 1 단계 : 프로젝트 ID. 당신은 당신의 데이터 파일을 저장할 폴더를 지정합니다. 2 단계 : 세션 이름입니다. '세션'상자에 실험 날짜 예를 들어, 어떤 단어를 입력하고 시작 시간과 백색 잡음과 footshock의 기간을 '참조'상자에 기록되어있는 참조 텍스트 파일을 선택합니다. 샘플 텍스트 파일은 비디오에 표시됩니다. 3 단계 : 매개 변수 설정. 다음과 같이 각각의 상자에 매개 변수 값을 입력합니다. 속도 (프레임 / 초) : 이미지 수집의 프레임 속도, 예를 들어 1 프레임 / 초. 재생 시간 (초) : 에어컨의 경우, 전체 지속 시간은 480 초이다. 빈 재생 시간 (초) : 예를 들면 60 초는, 데이터가 각 블럭에서 분석60 초. 제목 크기 – 분 (픽셀) : ImageFZ 각 이미지의 흰색 배경에 검은 색 입자 (픽셀의 일부 질량)로 마우스와 소음을 감지합니다. 블랙 입자 (화소)의 면적이 '주제어 크기 – 분 (화소)'보다 작 으면 값 (예를 들면 100 화소), 입자는 노이즈로서 간주되고, 이미지 분석에서 제외된다. 막스 (화소) – 피사체 사이즈 : 흑색 입자의 크기는 '주제어 크기 – MAX (화소)'의 사이즈보다 때 값 입자는 분석에서 제외된다. 프레임 크기 – 폭 / 높이 (cm) : 실의 차원, 즉, 33cm 폭 25cm 높이. 기준 (픽셀) 냉동 : 30 픽셀 예를 들어, 프로토콜 6의 내용을 참조하십시오. 시간을 냉동 – 분 (초) : 예를 들어, 2 초, 더 마우스 움직임 만 2 이상의 초 동안 감지되지 않으면, 그 동작은 '동결'로 계산되지 않습니다;. 충격 속도 (프레임 / 초) : 프로토콜 6의 내용을 참조하십시오. 4 단계 : 제목 ID입니다. 주제 ID를 입력합니다. 5 단계 : 카메라 설정. 밝기와 촬영 화상의 명암을 제어한다. 6 단계 : 임계 값 설정. 각 이미지에 흰색 배경에 검정색 픽셀로 블랙 마우스를 감지 임계 값을 조정하고 (프로토콜 6의 상세 내용보기) '동결'또는 '비 동결'으로 마우스 동작을 판단 할 수 있습니다. 흰둥이 마우스를 분석하려면, 체크 박스 '반전 모드'를 클릭하고, 적절하게 임계 값을 조정합니다. 7 단계 : 설정 케이지 필드. 캡처 할 각 실의 필드를 지정합니다. 도구 상자에서 사각형 버튼을 클릭 한 후, 라이브 이미지 창에서 챔버의 바닥 주위에 사각형을 그립니다. 다음으로, 챔버 번호를 선택하고 '설정'버튼을 클릭합니다. 마지막으로, '완료'버튼을 클릭합니다. <파라미터 설정이 설정된 리> 후, 예비 테스트는 이미지 분석 시스템 및 백색 잡음 / 충격 발생기 문제없이 작동 여부를 확인하는 일의 우선 검사 전 연습 생쥐 (주제로 사용되지 않는 마우스)를 사용하여 주어질 것이다. 인접 대기실에서 방음 테스트 룸에 연습 마우스를 포함하는 홈 케이지를 이동하고 조절 실에서 각 마우스를 놓습니다. 즉시 챔버에 마우스를 배치 한 후, I​​mageFZ의 시작 버튼을 클릭합니다. 응용 프로그램 소프트웨어를 사용하면 참조 파일에 지정된 순서로 마우스에 청각 신호 및 / 또는 전기 footshocks을 선물 할 것이다. 480 초 경과 후, 자신의 홈 케이지에 마우스를 반환하고 대기실에있는 선반에 새장을 반환합니다. 주의 깊게 챔버를 청소합니다. 그런 다음, '다음 분석'버튼을 클릭하고 테스트 마우스 단계를 3.2.4-3.6 반복합니다. ImageFZ 저장 살고 TIFF 형식으로 이미지를 추적. 프로그램은 허용우리는 수정 된 파라미터 값을 이용하여 영상을 다시 분석 할 오프라인 분석을 수행한다. 오프라인 분석을 수행 할 경우, 메뉴 플러그인 '공포 컨디셔닝 및 FZ 오프라인'을 선택하고 다시 분석 할 데이터 폴더를 선택합니다. 그 후, 입력 매개 변수 값을 다시하고 '완료'버튼을 클릭합니다. 4. 상황에 맞는 테스트 컨디셔닝 세션이 완료된 후, 마우스는 동일한 조화 챔버로 복귀하고 문맥 가동 두려움 (컨텍스트 테스트)을 측정하는 동작을 오해 얻었된다. 조절하고 상황에 맞는 테스트 사이의 지연 간격은 일반적으로 24 시간으로 설정되어 있습니다. 이 프로토콜, 최근의 메모리와 25 (각각 테스트 1 일 및 더 많은 28 일 정돈 한 후, 측정) 원격 메모리를 평가하기 위해, 마우스는 상황에 맞는 테스트 컨디셔닝 세션 후 약 24 시간 및 30 일에 실시한다. 마우스는 응축에 배치됩니다챔버를 itioning 자유롭게 CS와 미국 프리젠 테이션 (그림 2C)없이 300 초 동안 챔버를 탐험 할 수있다. ImageFZ 소프트웨어 프로그램을 실행하고 컨디셔닝 (3.2.3 절 참조)와 동일한 방식으로 응용 소프트웨어의 매개 변수 값을 설정하지만, 300 초에이 시험의 계속 시간을 수정하고 컨텍스트 시험 참조 텍스트 파일을 선택 . 설정을 변경 한 후, 예비 테스트는 ImageFZ 시스템을 확인하는 연습 마우스를 사용하여 제공해야한다. 조절 실에 각 마우스를 놓고 시작 버튼을 클릭합니다. 300 초 경과 후, 자신의 홈 케이지에 마우스를 반환하고, 큐 테스트가 시작될 때까지 그대로 케이지를 둡니다. 챔버를 청소합니다. 그런 다음, '다음 분석'버튼을 클릭하는 과정을 반복 테스트 생쥐의 4.3-4.4 단계를 반복합니다. 5. 큐 테스트 큐 시험은 상황에 맞는 시험 당일 또는 다음날에 실시된다.이 시험에서 마우스는 3 분의 조화 챔버 관련이 새로운 컨텍스트를 제공, 매우 다른 특성을 가진 다른 시험 챔버에 배치됩니다. 제 3 분의 끝에, 냉방시에 제시 청각 신호는 신규 한 컨텍스트 환경에서 3 분 동안 마우스에 주어진다. 이 프로토콜에서는, 큐 시험은 몇 시간 상황에 맞는 테스트 후 수행됩니다. 마우스는 360 초 동안 삼각 실을 탐험 할 수 있습니다. 처음 3 분에, CS도 미국도 제시되고, 그 후, CS (55dB 화이트 노이즈)가 지난 3 분 동안 표시됩니다. ImageFZ 소프트웨어 프로그램을 실행하고, 360 초까지 시험의 계속 시간을 수정하고 큐 테스트 참조 텍스트 파일을 선택을 제외하고, 냉방과 동일하게 파라미터 값을 설정. 설정을 조정 한 후, 예비 테스트는 ImageFZ 시스템을 점검하는 연습 생쥐를 사용 주어져야한다. 삼각 실에 각 마우스를 놓고 시작을 클릭합니다버튼을 누릅니다. 360 초 경과 후, 자신의 홈 케이지에 마우스를 반환하고 보류 실의 선반에 새장을 반환합니다. 챔버를 청소합니다. 그런 다음, '다음 분석'버튼을 클릭하고 반복 시험 생쥐에서 5.3-5.4 단계를 반복합니다. 또한, 원격 메모리를 테스트 4 ~ 30 일 정도 조절 세션 (그림 2A) 후 프로토콜을 반복합니다. 6. 이미지 분석 자동 ImageFZ를 사용하여 데이터 수집 및 분석을 수행합니다. 이 응용 프로그램 소프트웨어 프로그램은 츠요시 미야가와에 의해 수정 (국립 보건 연구소와 http://rsb.info.nih.gov/ij/에서 사용할 수에 웨인 Rasband에 의해 개발) 공​​개 소프트웨어 ImageJ에 프로그램 (ImageFZ 응용 프로그램 소프트웨어를 기반으로 , 무료로 다운로드 할 수는) 재료 / 시약의 표를 참조하십시오. 모든 실험에서, 등, USB 비디오 캡처 장치를 사용 ImageFZ와 관련 프레임 레이트 (예를 들면 1 fps)의 이미지를 캡처비디오 카메라. , 연속 이미지에서 이동 한 거리를 측정 검은 입자 (마우스)와 흰색 배경에 세그먼트 이미지로 설정되어있는 프로그램 (예를 들어 80 픽셀)의 '임계 분'값을 조정합니다. 여행 한 거리를 XY의 각 세트 사이의 거리가 연속 된 이미지에서 입자의 무게 중심 좌표를 계산한다. 다음 '임계 분 (XOR)', 연속적인 이미지에서 냉동 동작을 측정을 조정하는 검은 입자 (마우스)와 배경에 세그먼트 이미지로 설정되어있는 프로그램 (예 : 160 픽셀)의 값과 계산 연속 된 이미지의 각 쌍의 입자 사이에 겹치지 않는 영역의 영역 (픽셀)의 양. 각 이미지의 검은 입자 꼬리 제외한 마우스의 몸 전체의 형상과 일치 할 때까지 임계 공구의 슬라이더를 이용하여 값을 조정한다. 만약 nonoverla의 영역지역을 pping하는 '냉동 기준'값 (예를 들어 30 픽셀) 이하, 동작은 일반적으로 호흡과 심장 박동을 제외한 모든 운동의 완전한 부재로 정의된다 (그림 3), '동결'로 간주됩니다. 영역이이 값을 초과하면, 동작은 '비 – 냉동'(도 3)로 간주된다. 판단은 냉동의 정의에 기초해야한다. 마우스는 종종 미묘한 움직임과 두려움을 반영하는 냉동 행동으로 간주되지 않을 수 있습니다 순간 부동을 나타낸다. 공포의 발현에서 예상과 다른 짧은 시간 (예를 들면 2 초 이하) 동안 지속 부동성은 냉동 시간 임계 값을 설정하여 분석에서 제외 될 수있다. 값 (예 : 2 초) – 시간 임계 값, 입력 '분 (초) 시간을 동결'을 설정합니다. 자동 calcul을 ImageFZ 프로그램ATES는 거리 (cm)과 냉동의 백분율을 여행했다. 결과는 텍스트 파일에 저장하고, 생활하고 이미지를 TIFF 형식으로 저장됩니다 추적됩니다. 거리 전기 footshock 감도의 지표로 (CM)를 여행을 측정하기 위해, ImageFZ 프로그램은 또한 2 때까지 2 초 footshock의 납품의 앞에 2 초에서 측정 한 6 초 동안 높은 프레임 속도 (예를 들면 4 FPS) 영상을 획득 초 온라인 분석하는 동안 footshock 후. 동안, 전에 이미지 캡처를위한 프레임 속도를 설정하고 footshock,의 입력 값 '충격 속도 (프레임 / 초)'상자 후. 온라인 분석 한 후, 이동 한 거리에 대한 데이터를 얻기 위해 메뉴 플러그인 'FZ 충격 오프라인'을 선택하여 오프라인 분석을 수행 할 수 있습니다. ImageFZ 프로그램의 파라미터 값은 예비 시험에서 인간 관측자에 의해 수득 된 것과 유사한 결과를 생성하도록 최적화되어야한다. 수동 기록, 냉동 동작이 연속적 stopwatc를 사용하여 측정된다H 및 이벤트 녹화 프로그램 ImageFZ 또는 소프트웨어를 사용하여 분석 중 순시 시간 – 샘플링 절차마다 3-10 초. 두 관찰자는 일반적으로 행동 관찰을 실시하고 있습니다. , 이미지 분석의 결과는 인간 관찰자의 것과 일치되도록 ImageFZ 프로그램의 매개 변수 값을 조정 ImageFZ 프로그램의 오프라인 분석을 수행, '임계 분 (XOR)을'수정 및 '동결 조건'값 . 오프라인 분석을 수행하기 위해, 플러그인 메뉴 'FZ 오프라인'입력 매개 변수 값을 선택합니다. 7. 문제 해결 어떻게 ImageFZ 프로그램을 얻어 설치할 수 있습니까? ImageFZ 프로그램 (재료 / 시약의 표 참조) 우리의 웹 사이트에서 무료로 다운로드 가능하며, Windows 컴퓨터에서 실행됩니다. ImageFZ에 대한 ZIP 폴더를 다운로드하여 컴퓨터에 소프트웨어를 설치합니다. installati의 '의 readme.txt'파일을 참조세부 사항들에 대한 단계별 지침을 따르십시오. 왜 오류 메시지 '오류 설정 캡처 장치는'표시? 카메라 케이블의 연결과 USB 이미지 캡처 장치의 드라이버 설치를 확인하십시오. 설정에 문제가 없다면, 다음 ImageFZ 소프트웨어는 영상 획득 장치와 함께 작동하지 않을 수 있습니다. ImageFZ 소프트웨어와 함께 사용할 수있는 적절한 장치에 관한 '의 readme.txt'파일을 참조하십시오. ImageFZ은 입자로 쥐의 몸 전체를 검색 할 수 없습니다. '임계 분'및 / 또는 '임계 분 (XOR)'전류 값보다 낮은 값을 설정. ImageFZ는 예를 들면 시험 챔버의 코너 특정 위치에 마우스를 감지 할 수없는 경우에는 그러한 균일 조명 바닥이나 마우스와 배경 사이 약간 대조 차이 불충분 시험 조건이 존재할 수있다. 이 문제를 해결하기 위해 매개 변수 값 (예, 조정 </eImageFZ의 M> 밝기와 라이브 영상 및 임계 값의 대비가), 조명의 수와 위치를 제어하거나, 블랙 마우스 흰색 배경을 사용합니다. 높은 프레임 속도로 이미지 캡처 온라인 분석 중에 컴퓨터 속도가 느려집니다. 현재 속도보다 낮은 값으로 프레임 속도를 설정하고, 온라인 분석을 수행합니다. 대표적인 결과 섹션 같이 ImageFZ 분석 1, FPS에서 화상 취득을 통해, 정확하게 냉동 측정 충분하다. ImageFZ 분석의 결과는 인간의 점수들에 동의하지 않습니다. 저장된 이미지 및 판정 결과 파일을 검사합니다. ImageFZ 동결 과대 평가하는 경우, 현재의 값보다 낮은 값으로 '동결 기준'을 설정하고, 오프라인 분석을 수행 할 수 있습니다. ImageFZ 동결을 과소 평가하는 경우, 현재의 값보다 높은 값으로 '동결 기준'을 설정합니다. optogenetical 및 생체 전기 생리학 전자에xperiments, 쥐의 머리에 부착 된 광섬유 케이블은 냉동 판정을 방해. 코트는 블랙 마우스 흰색의 케이블 및 케이블이 감지되지 않습니다 때까지 카메라의 위치와 각도를 변경합니다. 무엇은 오프라인 분석을 위해 필요합니까? ImageFZ 프로그램의 루트 디렉토리에 'Image_FZ'라는 이름의 폴더를 만듭니다. 이 폴더에 하위 폴더 '이미지'와 '세션'을 만들 수 있습니다. '이미지'폴더에 8 비트 그레이 스케일 이미지를 이동 및 이미지 파일의 이름 '세션'폴더에 기록되어있는 텍스트 파일을 생성. 그 후, I​​mageFZ 오프라인 분석을 실행하고 프로그램의 지침을 따르십시오.