Ensaios para a identificação de novos antivirais contra a febre catarral ovina vírus

BTV é um protótipo de cadeia dupla de RNA vírus do gênero Orbivirus, família Reoviridae. BTV é uma das doenças mais importantes da pecuária nacional, incluindo ovelhas, cabras, gado e outros animais domésticos, com a perda de 3.000 milhões dólares americanos / ano em todo o mundo ^1,2. O exótico sorotipo BTV é um importante patógeno animal enumerados nas "USDA alta Consequence Pecuária Patógenos". Recentemente, o re-emergente de BTV causou um grande surto da doença em bovinos e ovinos em vários países em todo o norte da Europa ^3,4. Como resultado do seu significado económico e como um sistema modelo, BTV tem sido o objecto de estudos moleculares, genéticos e estruturais extensas, e várias vacinas têm sido desenvolvidos. No entanto, devido à falta de ensaios adequados para a descoberta da droga anti-viral, não existem medicamentos antivirais disponíveis contra BTV.

Em recente pesquisa de alto rendimento campanha (HTS), utilizando o sistema BTV como modelo, nós developed, otimizado e validado um ensaio baseado em CPE para identificar potenciais antivirais de amplo espectro contra arbovírus ^5. Ensaio baseado CPE é um ensaio bem conhecido que tem sido utilizado na descoberta de drogas anti-viral contra um número de vírus que induzida rápida e observável CPE / apoptose ^5-7. No nosso sistema, infecção pós BTV, CPE é evidente em células de vertebrados, incluindo HeLa, BSR, e HEK 293T ^8. CPE induzida por vírus da febre catarral pode ser monitorizada e quantificado usando vários métodos de detecção de viabilidade celular, incluindo o kit de reagente de viabilidade celular CellTiter Glo (kit CTG) ^9. Este kit determina o número de células viáveis ​​em cultura com base na quantificação de ATP celular apresentado, o que sinaliza a presença de células vivas, metabolicamente activas. Sob condições otimizadas, o ensaio baseado em CPE aqui apresentado mostrou sua viabilidade com o protocolo de um passo "misturar e medir", e flexibilidade com sinais luminescentes estáveis. Enquanto isso, os compostos tóxicos reducing viabilidade celular irá ser excluída no presente ensaio baseia-CPE. O ensaio baseado CPE mostrou a sua robustez e fiabilidade para a descoberta da droga anti-viral contra o vírus da febre catarral, e tem sido utilizada para rastrear o NIH Molecular Bibliotecas de Moléculas Pequenas Repository (MLSMR), que conduz à identificação de seis novos aglomerado de potencial composto principal antiviral (s ) ^5.

Quando um composto antiviral potencial foi identificado usando o ensaio baseado em CPE, que terá de ser submetida ao ensaio de dose-resposta de dez concentração para determinar o intervalo de eficácia antiviral e citotoxicidade ^2. A eficácia antiviral, representada como a concentração inibidora 50% _(IC50) ou a concentração eficaz 50% (CE _50), é a concentração de uma droga que inibe a CPE induzida por vírus a meio caminho entre a linha de base e no máximo. A citotoxicidade dos antivirais, ou seja, a concentração de 50% de citotoxicidade (CC _50), é a concentraçãode um fármaco induzir 50% de citotoxicidade entre a linha de base e no máximo. O índice selectivo (SI), denotada como 50% de Si (SI ₅₀₎ é calculado a partir de _CC50 / IC _50, que determina a especificidade do anti-viral contra a CPE induzida por vírus. A _IC50 (ou _EC50), CC ₅₀ e SI ₅₀ valores são medidas importantes para determinar se um composto antiviral é potente e selectivo para o desenvolvimento de drogas.

Quando um antiviral mostrou nenhuma toxicidade manifesta in vitro, no entanto, impedido de vírus induzido CPE e o ciclo de vida viral produtiva, é importante caracterizar a sua MOA ^2. Iniciamos tal caracterização através da realização de ensaio ToA para determinar a possível etapa (s) do ciclo de vida viral que é afetada pelo antiviral. Geralmente, composto antiviral foram adicionados às células em diferentes épocas pré-ou pós-infecção de vírus. Se os antivirais foram adicionados às células infectadas pôr ao seu alvo step durante o curso da infecção, ela iria resultar em menor actividade, quando comparada com a que foi adicionada antes do passo. Assim, o estudo ToA é crítico para a determinação da eficácia anti-viral de um composto, e o seu alvo potencial, quer no ciclo de vida viral ou a máquina hospedeira envolvidas no ciclo de vida viral.

Para todos os três ensaios, a viabilidade celular foi determinada utilizando o kit CTG seguindo as instruções do fabricante ^5. Este sistema de detecção emite sinais de luminescência adequadas que poderiam ser analisadas por diversos softwares em casa. Cada ensaio foi validado e executada, pelo menos, em triplicado, com oito réplicas. Para todos os dados obtidos, três parâmetros, incluindo o valor médio (AVE), o desvio padrão (STDEV), e variação de co-eficiente (CV) foram analisados ​​para determinar a robustez do ensaio. Uma vez que a robustez do ensaio foi determinado, os dados irão ser ainda analisada e representada usando vários biostatics e graficaferramentas c ^2.