Микрофлюидных На чипе Захват-циклоприсоединения Реакция на Обратимо Остановите малых молекул или многокомпонентные структуры для биосенсора приложений
Summary
Мы представляем метод для быстрого, обратимые иммобилизации малых молекул и функционализованных ансамблей наночастиц для поверхностного плазмонного резонанса (SPR) исследований, с помощью последовательного на-чипе bioorthogonal химия циклоприсоединение и антитело-антиген захвата.
Abstract
Методы быстрого поверхности иммобилизации биологически активных малых молекул с контролем над ориентации и плотности иммобилизации весьма желательны для биосенсора и микрочипов приложений. В этом исследовании, мы используем высокоэффективную ковалентную bioorthogonal [4 +2] циклоприсоединения реакции между транс-циклооктена (TCO) и 1,2,4,5-тетразин (TZ) для того, чтобы микрофлюидных иммобилизации TCO / Tz-производные молекул . Мы контролировать процесс в режиме реального времени в условиях непрерывного потока с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Чтобы включить обратимой иммобилизации и продлить экспериментальный спектр поверхности датчика, совместить нековалентная антиген-антитело компонент захвата с реакцией циклоприсоединения. По поочередно представляя TCO или TZ фрагменты на поверхность датчика, несколько процессов захвата-циклоприсоединения в настоящее время возможно только на одной поверхности датчика для на чипе сборки и взаимодействия исследований различных многокомпонентных конструкций. Мы яllustrate этот метод с двух различных экспериментах иммобилизации на чипе биосенсора; небольшой молекулы, AP1497, который связывается FK506-связывающий белок (12 FKBP12) и той же небольшой молекулы, как часть иммобилизованным на месте и функциональными наночастицы.
Introduction
Эффективные реакции сопряжения являются ценными инструментами для крепления биоактивные молекулы на поверхности для различных биотехнологических приложений. В последнее время очень быстро bioorthogonal [4 +2] циклоприсоединения между транс-циклооктена (TCO) и 1,2,4,5-тетразин (Tz) был использован для обозначения поверхности клеток, субклеточных структур, антитела и наночастиц 1. – 7 Здесь мы используем реакцию [4 +2] циклоприсоединения в сочетании с захватом антигена / антитела (GST / анти-GST) для обратимого на-чипе синтеза многокомпонентных структур для поверхностного плазмонного резонанса (SPR) анализа взаимодействия и мониторинга Процесс в режиме реального времени (рис. 1). 8,9 Примечательно, что стратегия захвата-циклоприсоединения позволяет регенерацию поверхности с помощью установленным протоколом. 8 Как следствие, собраний стабильных поверхностей датчиков с контроля над лиганда ориентации и плотности для различных нового анализа Форматы теперь это возможно. Использованиеэта стратегия мы демонстрируем иммобилизации TCO / Tz-производные малых молекул и характеризуют темпы циклоприсоединения в различных условиях буфера. Мы выбрали известную взаимодействие между FKBP12 и AP1497 молекулы, который связывает FKBP12 10-12 в качестве примера для проверки того, что стратегия захвата-циклоприсоединения сохраняет способность малых молекул взаимодействовать с своей цели, когда либо непосредственно связанными с иммобилизованными GST антигенов или иммобилизованных наночастиц (NPS).
Этот метод имеет несколько преимуществ. Во-первых, обратимы иммобилизация малых молекул на сенсорных чипов теперь это возможно. Во-вторых, TCO / Tz иммобилизация малых молекул также позволяет этикеток без исследования взаимодействия, призванным устранить ориентацию канонических SPR исследований, и может обеспечить дополнительную вид обязательного взаимодействия. В-третьих, этот метод позволяет микрофлюидных синтез целевых наночастиц и немедленной оценки их bindinг свойствами. Это обещает повысить эффективность оценки или скрининга целевых наночастиц, а также уменьшить количество необходимых наночастиц. 13-15 В-четвертых, этот подход может измерять кинетики реакции из bioorthogonal реакций циклоприсоединения в реальном времени при непрерывном потоке. Наконец, иммобилизация химии TCO / Tz является надежной в присутствии сыворотки. Взятые вместе, мы ожидаем, что этот универсальный подход широко облегчить строительство стабильных поверхностей датчиков для широкого спектра микрофлюидных исследований, имеющих отношение к в пробирке и в естественных клеточных приложений.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод захвата-циклоприсоединения описано здесь позволяет быстро, обратимые иммобилизации модифицированных наночастиц и малых молекул для чипа на основе взаимодействия без наклеек и кинетических исследований. Протокол иммобилизации может быть выполнена в течение нескольких минут, ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы признаем, финансирование из NIH (NHLBI Договор № HHSN268201000044C чтобы RW, SH и SYS).
Materials
| Reagent | |||
| Sensor Chip CM5 | GE Healthcare | BR-1005-30 | |
| Amine coupling kit | GE Healthcare | BR-1000-50 | |
| GST capture kit | GE Healthcare | BR-1002-23 | |
| NAP-10 Columns | GE Healthcare | 17-0854-01 | |
| GST, lyophilized in 1X PBS | Genscript | Z02039 | 1 mg/ml |
| rhFKBP12 | R&D Systems | 3777-FK | |
| Surfactant P-20 | GE Healthcare | BR-1000-54 | |
| Glycine 2.0 | GE Healthcare | BR-1003-55 | |
| Zeba spin desalting column | Thermo | 89882 | 7 K MWCO |
| Amicon Ultra 4 | Fisher | UFC810096 | 100 K centrifugal filter |
| TCO-OH | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| TCO-NHS | Ref. 8 | Synthesized in-house, *Commercially available from Click Chemistry Tools # 1016-25 | |
| Tz-BnNH2 | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| Tz-NHS | Ref. 8 | 764701 | Synthesized in-house, *Commercially available from Sigma Aldrich # 764701 |
| NP-NH2 = CLIO-NH2 | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| AP1497, AP1497-Tz | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| Equipment | |||
| SPR Biosensor | GE Healthcare | Biacore T100 |
References
- Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Haun, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition. Angew Chem Int Ed Engl. 48, 7013-7016 (2009).
- Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes. J Am Chem Soc. 134, 2898-2901 (2012).
- Haun, J. B., Devaraj, N. K., Marinelli, B. S., Lee, H., Weissleder, R. Probing intracellular biomarkers and mediators of cell activation using nanosensors and bioorthogonal chemistry. ACS Nano. 5, 3204-3213 (2011).
- Budin, G., Yang, K. S., Reiner, T., Weissleder, R. Bioorthogonal probes for polo-like kinase 1 imaging and quantification. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 9378-9381 (2011).
- Liu, D. S., Tangpeerachaikul, A., Selvaraj, R., Taylor, M. T., Fox, J. M., Ting, A. Y. Diels-Alder cycloaddition for fluorophore targeting to specific proteins inside living cells. J Am Chem Soc. 134, 792-795 (2012).
- Haun, J. B., Devaraj, N. K., Hilderbrand, S. A., Lee, H., Weissleder, R. Bioorthogonal chemistry amplifies nanoparticle binding and enhances the sensitivity of cell detection. Nat Nanotechnol. 5, 660-665 (2010).
- Liong, M., et al. Specific pathogen detection using bioorthogonal chemistry and diagnostic magnetic resonance. Bioconjug Chem. 22, 2390-2394 (2011).
- Tassa, C., et al. On-chip bioorthogonal chemistry enables immobilization of in situ modified nanoparticles and small molecules for label-free monitoring of protein binding and reaction kinetics. Lab Chip. 12, 3103-3110 (2012).
- Pol, E. The importance of correct protein concentration for kinetics and affinity determination in structure-function analysis. J Vis Exp. (37), e1746 (2010).
- MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).
- Ong, S. E., et al. Identifying the proteins to which small-molecule probes and drugs bind in cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4617-4622 (2009).
- Tassa, C., et al. Binding affinity and kinetic analysis of targeted small molecule-modified nanoparticles. Bioconjug Chem. 21, 14-19 (2010).
- Weissleder, R., Kelly, K., Sun, E. Y., Shtatland, T., Josephson, L. Cell-specific targeting of nanoparticles by multivalent attachment of small molecules. Nat Biotechnol. 23, 1418-1423 (2005).
- Yuan, J., Oliver, R., Aguilar, M. I., Wu, Y. Surface plasmon resonance assay for chloramphenicol. Anal Chem. 80, 8329-8333 (2008).
- Myung, J. H., Gajjar, K. A., Saric, J., Eddington, D. T., Hong, S. Dendrimer-mediated multivalent binding for the enhanced capture of tumor cells. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11769-11772 (2011).
- Keelan, J. A. Nanotoxicology: nanoparticles versus the placenta. Nat Nanotechnol. 6, 263-264 (2011).
- Lundqvist, M., Stigler, J., Elia, G., Lynch, I., Cedervall, T., Dawson, K. A. Nanoparticle size and surface properties determine the protein corona with possible implications for biological impacts. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14265-14270 (2008).
- Lundqvist, M., et al. The evolution of the protein corona around nanoparticles: a test study. ACS Nano. 5, 7503-7509 (2011).
- Mammen, M., Choi, S. -. K., Whitesides, G. M. Polyvalent interactions in biological systems: implications for design and use of multivalent ligands and inhibitors. Angew Chem Int Ed Engl. 37, 2754-2899 (1998).
- Kausaite-Minkstimiene, A., Ramanaviciene, A., Kirlyte, J., Ramanavicius, A. Comparative study of random and oriented antibody immobilization techniques on the binding capacity of immunosensor. Anal Chem. 82, 6401-6408 (2010).
- Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. 3, 301-317 (2004).
- Giannetti, A. M., Koch, B. D., Browner, M. F. Surface plasmon resonance based assay for the detection and characterization of promiscuous inhibitors. J Med Chem. 51, 574-580 (2008).
- Kimple, A. J., Willard, F. S., Giguere, P. M., Johnston, C. A., Mocanu, V., Siderovski, D. P. The RGS protein inhibitor CCG-4986 is a covalent modifier of the RGS4 Galpha-interaction face. Biochim Biophys Acta. 1774, 1213-1220 (2007).
- GE Healthcare. . Biacore Sensor Surface Handbook BR-1005-71. , (2005).
