In-vivo-Imaging-Methode zu unterscheiden, akuten und chronischen Entzündungen
Summary
Wir beschreiben ein nicht-invasives Verfahren zur Unterscheidung entzündlichen Phasen. Systemische Lieferung von Luminol zeigt Bereiche der akuten Entzündung abhängig MPO-Aktivität in neutrophilen Granulozyten. Im Gegensatz dazu ermöglicht das Einstreuen Lucigenin zur Visualisierung der chronischen Entzündung abhängig Phox Aktivität in Makrophagen.
Abstract
Die Entzündung ist ein grundlegender Aspekt der vielen menschlichen Krankheiten. In diesem Video-Bericht zeigen wir, nicht-invasive bildgebende Verfahren, die Biolumineszenz akuten und chronischen Entzündungen in Maus-Modellen zu unterscheiden. Mit Gewebeschädigung oder Erreger Invasion, sind Neutrophile die erste Linie der Verteidigung, spielen eine wichtige Rolle bei der Vermittlung der akuten Entzündungsreaktion. Da die entzündliche Reaktion fortschreitet, zirkulierenden Monocyten allmählich in der Stelle der Verletzung zu migrieren und differenzieren zu reifen Makrophagen, die chronische Entzündung zu vermitteln und zu fördern Gewebereparatur durch Entfernen Gewebedebris und Herstellung anti-inflammatorische Zytokine. Die intraperitoneale Injektion von Luminol (5-Amino-2 ,3-dihydro-1 ,4-phthalazindion, Natriumsalz) ermöglicht den Nachweis einer akuten Entzündung weitgehend von Gewebe infiltrierenden Neutrophilen vermittelte. Luminol reagiert spezifisch mit dem Superoxid innerhalb der phagosomes von Neutrophilen seit Biolumineszenz Ergebnisse aus einer Myeloperoxidase (M erzeugtPO) vermittelte Reaktion. Lucigenin (bis-N-methylacridinium Nitrat) reagiert auch mit Superoxid um Biolumineszenz zu erzeugen. Allerdings ist Lucigenin Biolumineszenz unabhängig von MPO und es verlässt sich einzig auf Phagozyten NADPH-Oxidase (Phox) in Makrophagen während der chronischen Entzündung. Zusammen ermöglichen Luminol und Lucigenin nichtinvasive Visualisierung und Längs Bewertung verschiedener Populationen Phagozyten in akuten und chronischen entzündlichen Phasen. Angesichts der wichtigen Rolle der Entzündung in einer Vielzahl von menschlichen Krankheiten, glauben wir diese nicht-invasiven bildgebenden Verfahren können die differentiellen Untersuchung Rollen von Neutrophilen und Makrophagen in einer Vielzahl von pathologischen Zuständen.
Introduction
Die Entzündung ist eine stark regulierte biologische Reaktion in einer Vielzahl von Krankheiten, einschließlich mikrobieller Infektion beteiligt 1, 2 Wundheilung, Diabetes 3, 4 Krebs, Herz-Kreislauf 5, 6 neurodegenerativen und Autoimmunerkrankungen 7. Entzündung im Gewebe erfordert eine sachgerechte Koordinierung der verschiedenen Immunzellen, um Erreger-Clearance, die Reparatur von Gewebe und Krankheiten Auflösung zu erreichen. Neutrophile und Makrophagen sind wichtige Immunmediatoren der Entzündung im Gewebe. In der akuten Phase der Entzündung, Neutrophile sind die ersten Responder auf verschiedene schädliche Reize und Gewebeschäden 8. Die Neutrophilen schnell extravasieren von Umlauf zu der Stelle der Verletzung, wo die Zellen eindringende Mikroben durch Loslassen antimikrobielle Granulat und Phagozytose inaktivieren. Während Phagozytose, verschlingen eindringende Mikroben Neutrophilen in phagosomes, in dem die Zellen produzieren hohe Superoxidide (O 2 · -). Phagosomes Superoxid ist die primäre Quelle von vielen nachgelagerten reaktive Sauerstoffspezies (ROS). Beispielsweise können Superoxid, Wasserstoffperoxid (H 2 O 2) durch spontane Dismutation oder Superoxid-Dismutase (SOD) 9, 10 disproportionierten werden. In Neutrophilen, Myeloperoxidase (MPO) wandelt ferner Wasserstoffperoxid zu antimikrobielle hypochlorige Säure (HOCl) 11. Da die entzündlichen Reaktionen weiter, zirkulierenden Monozyten allmählich in den Ort der Verletzung zu migrieren und differenzieren zu reifen Makrophagen 2, dessen phagocytic Funktion zur Beseitigung von inaktivierten Krankheitserregern und Zelltrümmer. Darüber hinaus als wichtiger Regulator in der späteren Phase der Entzündung, fördert die Makrophagen die Reparatur von Gewebe durch die Herstellung anti-inflammatorischen Zytokinen 12 und durch die Generierung von extrazellulären ROS auf einem niedrigeren Niveau 9. Die ROS an diesem späteren Zeitpunkt generiert regulieren Gewebeumbau, Gefäßneubildung und reepitheliasierung 13.
Phagocyte NADPH-Oxidase (Phox) ist die primäre Quelle der Superoxid-Produktion in beiden Neutrophilen und Makrophagen 9. Phox ist ein Multi-Untereinheiten-Komplex, dessen Montage dicht 9 geregelt. Das Holoenzym enthält mehrere cytosolischen regulatorischen Untereinheiten (p67 phox, p47 phox, p40 phox und RAC) und eine Membran-gebundene Cytochrom b Heterodimer 558 (aus der Untereinheit CYBA und CYBB). Cytochrom b 558 ist die Reaktion Kern, in dem die CYBB Untereinheit (auch als p91 phox und NOX2 bekannt) führt die primäre Redox-Kettenreaktion 9. Interessanterweise sind die Montage zwischen verschiedenen Standorten Neutrophilen und Makrophagen. In ruhenden neutrophilen Granulozyten Cytochrom b 558 hauptsächlich in der Membran des intrazellulären Speichergranula 14. Während Phagozytose, montieren die Neutrophilen holoenzymes bei phagosomes 9, wo ein hohes Maß an MPO-Aktivität sind ebenfalls vorhanden. Die Neutrophilen Phox schnell verbraucht Sauerstoff und übt seine Macht durch mikrobizider ROS-Produktion, bezeichnet ein Phänomen, das respiratory burst 11. Im Gegensatz dazu haben Makrophagen eine niedrigere MPO Expression und Cytochrom b 558 hauptsächlich in der Plasmamembran 15, 16 vorhanden. So Neutrophilen hohe Mengen von Superoxid für eine antimikrobielle Aktivität, während Makrophagen weniger Superoxid für regulatorische Funktionen 15 zu erzeugen.
Seit Entzündung ist ein kompliziertes Verfahren in vivo, würde nicht-invasiven bildgebenden Verfahren spezifisch für verschiedene Phasen der Entzündung und damit quantitative Einschätzung der Längs-Krankheit Modellen. Mit mechanistische Studien haben wir zuvor die Verwendung von zwei chemilumineszierende Mittel, Luminol (5-Amino-2 ,3-dihydro-1 ,4-phthalazindion) und Lucigenin (bis-N-methylacridinium Nitrat) nachgewiesen, Zur nicht-invasiven Darstellung von akuten und späten (chronischen) Stadien der Entzündung bzw. 17. Luminol ermöglicht die Visualisierung der neutrophilen MPO-Aktivität in der akuten Phase der Entzündung 18-20, während Lucigenin Biolumineszenz kann verwendet werden, um Makrophagen-Aktivität in Verbindung mit der späten Phase oder chronische Entzündung 17 beurteilen. In diesem Manuskript, verwendeten wir zwei experimentelle Entzündung Modelle (sc sc PMA und LPS), um diese bildgebenden Verfahren zu demonstrieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Bericht zeigen wir, eine Biolumineszenz Verfahren zur nicht-invasive Bildgebung von Entzündungen in lebenden Tieren. Unter Ausnutzung der beiden Leuchtstoffe Substrate, Luminol und Lucigenin, kann das Verfahren unterscheiden verschiedene Phasen der Entzündung. Luminol Biolumineszenz mit neutrophilen Granulozyten in der akuten Phase der Entzündung assoziiert, während Lucigenin Biolumineszenz durch Makrophagen in der chronischen Phase vermittelt wird. Relativ kleine (MG = 177,16 g / mol) und elektrisch ungel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Nancy Lurie Marks Foundation unterstützt. Wir danken Dr. Nancy E. Kohl für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Wir danken K. Kin Wong für seine Unterstützung bei der Vorbereitung dieses Video Bericht.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | P8139 | |
| Lipopolysaccharide from Salmonella enterica serotype enteritidis | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | L2012 | |
| Luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione, sodium salt) | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | A4685 | |
| Lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate) | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | M8010 | |
| IVIS Spectrum imaging system with Living Imaging 4.2 software package | Caliper LS/Perkin Elmer, Hopkinton, MA |
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