In vivo Imaging för att skilja akut och kronisk inflammation
Summary
Vi beskriver en icke-invasiv imaging metod för att särskilja inflammatoriska stadier. Systemisk tillförsel av luminol avslöjar områden med akut inflammation beroende av MPO-aktivitet i neutrofiler. Däremot tillåter injektion av lucigenin för visualisering av kronisk inflammation beroende Phox aktivitet i makrofager.
Abstract
Inflammation är en grundläggande aspekt av många mänskliga sjukdomar. I den här videon rapporten visar vi icke-invasiva tekniker mareld avbildning som särskiljer akut och kronisk inflammation i musmodeller. Med vävnadsskada eller patogen invasion, neutrofiler är den första försvarslinjen, spelar en viktig roll i att medla det akuta inflammatoriska svaret. Som den inflammatoriska reaktionen fortskrider, cirkulerande monocyter vandrar gradvis i stället för skada och differentiera till mogna makrofager, som förmedlar kronisk inflammation och främja vävnadsreparation genom att ta bort vävnad skräp och producera anti-inflammatoriska cytokiner. Intraperitoneal injektion av luminol (5-amino-2 ,3-dihydro-1 ,4-ftalazindion, natriumsalt) möjliggör detektering av akut inflammation i stor utsträckning medieras av vävnadsspecifika infiltrerande neutrofiler. Luminol reagerar specifikt med superoxid genereras inom phagosomes av neutrofiler sedan mareld resultat från en myeloperoxidas (MPO)-medierad reaktion. Lucigenin (bis-N-metylakridinium nitrat) reagerar också med superoxid för att generera bioluminiscens. Dock är lucigenin mareld oberoende av MPO och det enbart förlitar sig på fagocytsystemet NADPH oxidas (Phox) i makrofager under kronisk inflammation. Tillsammans luminol och lucigenin tillåta icke-invasiv visualisering och longitudinell utvärdering av olika phagocyte befolkningar över både akuta och kroniska inflammatoriska faser. Tanke på den viktiga rollen av inflammation i en mängd olika humana sjukdomar, tror vi att denna icke-invasiv imaging metod kan hjälpa undersöka de differentiella roller neutrofiler och makrofager i en mängd olika patologiska tillstånd.
Introduction
Inflammation är en starkt reglerad biologiskt svar inblandad i en mängd humana sjukdomar, inklusive mikrobiell infektion 1, sårläkning 2, diabetes 3, cancer 4, hjärt-5, neurodegenerativa 6, och autoimmuna sjukdomar 7. Vävnadsinflammation kräver samordning av olika immunceller för att uppnå patogen clearance, vävnadsreparation och sjukdom upplösning. Neutrofiler och makrofager är viktiga immunmediatorer av vävnad inflammation. I den akuta fasen av inflammation, neutrofiler är de första som svarade till olika skadliga stimuli och vävnadsskada 8. De neutrofiler extravasera snabbt från cirkulationen till platsen av skadan, där cellerna inaktivera invaderande mikrober genom att släppa anti-mikrobiella granulat och fagocytos. Under fagocytos, uppsluka neutrofiler invaderande mikrober in phagosomes, inom vilken cellerna producerar höga nivåer av SuperoxIDE (O 2 · -). Phagosomal superoxid är den primära källan till många nedströms reaktiva syreradikaler (ROS). Exempelvis kan superoxid vara dehydrerat till väteperoxid (H 2 O 2) genom spontan dismutation eller genom superoxiddismutas (SOD) 9, 10. I neutrofiler, omvandlar myeloperoxidas (MPO) ytterligare väteperoxid till anti-mikrobiella hypoklorsyra (HOCl) 11. Eftersom de inflammatoriska svar fortsätter, cirkulerande monocyter vandrar gradvis i stället för skada och differentiera till mogna makrofager 2, vars fagocytos bidra till att undanröja inaktiverade patogener och cellrester. Dessutom, som en viktig regulator i den senare fasen av inflammation, främjar makrofag vävnadsreparation genom att producera anti-inflammatoriska cytokiner 12 och genom att generera extracellulära ROS på en lägre nivå 9. Den ROS genereras vid detta senare skede reglera vävnadsombildning, kärlnybildning och reepitheliasering 13.
Phagocyte NADPH oxidas (Phox) är den primära källan av superoxid produktion i både neutrofiler och makrofager 9. Phox är en multi-subenhet komplex vars montering är hårt reglerad 9. Holoenzymet innehåller flera cytosoliska regulatoriska subenheter (P67 phox, P47 phox, p40 phox och RAC) och ett membranbundet heterodimer cytokrom b 558 (består av subenhet CYBA och CYBB). Cytokrom B 558 är reaktionen kärnan inom vilken CYBB subenheten (även känd som P91 phox och NOX2) utför den primära redox kedjereaktion 9. Intressant, dess montering sajter är olika mellan neutrofiler och makrofager. I vilande neutrofiler, är cytokrom b 558 mestadels närvarande i membranet av intracellulära lagring granulat 14. Under fagocytos, neutrofiler montera holoenzymes at phagosomes 9, där höga nivåer av MPO-aktivitet är också närvarande. Den neutrofila Phox snabbt förbrukar syre och utövar sin microbicidal makt genom ROS produktion, kallas ett fenomen den respiratory burst 11. Däremot makrofager har en lägre nivå av MPO uttryck och cytokrom b 558 mest anträffas i plasmamembranet 15, 16. Således neutrofiler producerar höga nivåer av superoxid för anti-mikrobiell aktivitet, medan makrofager genererar mindre superoxid för reglerande funktioner 15.
Eftersom inflammationen är en invecklad in vivo-processen, skulle icke-invasiv imaging metoder specifika för olika faser av inflammation tillåter kvantitativ och longitudinell utvärdering av sjukdomstillstånd modeller. Använda mekanistiska studier har vi visat tidigare användningen av två kemiluminiscenta medel, luminol (5-amino-2 ,3-dihydro-1 ,4-ftalazindion) och lucigenin (bis-N-metylakridinium nitrat), För icke-invasiv avbildning av akuta och sena (kronisk) stadier av inflammation, respektive 17. Luminol möjliggör visualisering av neutrofil MPO-aktivitet i den akuta fasen av inflammation 18-20, medan lucigenin bioluminescens kan användas för att bedöma makrofagaktiviteten i association med den sena fasen eller kronisk inflammation 17. I detta manuskript, använde vi två experimentella inflammation modeller (SC PMA och SC LPS) för att visa dessa avbildningstekniker.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna rapport visar vi en mareld metod för icke-invasiv avbildning av inflammation i levande djur. Med utnyttjande av två självlysande substrat, luminol och lucigenin, kan metoden urskilja olika faser av inflammation. Luminol bioluminiscens är förknippat med neutrofiler i den akuta fasen av inflammation, medan lucigenin bioluminescens förmedlas av makrofager i den kroniska fasen. Relativt liten (molekylvikt = 177,16 g / mol) och elektriskt oladdade kan luminol lätt tränga både plasma och phagosomal membran <s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Nancy Lurie Marks Foundation. Vi tackar Dr Nancy E. Kohl för kritisk läsning av manuskriptet. Vi tackar Kin K. Wong för hans hjälp med att förbereda den här videon rapport.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | P8139 | |
| Lipopolysaccharide from Salmonella enterica serotype enteritidis | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | L2012 | |
| Luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione, sodium salt) | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | A4685 | |
| Lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate) | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | M8010 | |
| IVIS Spectrum imaging system with Living Imaging 4.2 software package | Caliper LS/Perkin Elmer, Hopkinton, MA |
References
- Premack, B. A., Schall, T. J. Chemokine receptors: gateways to inflammation and infection. Nat. Med. 2, 1174-1178 (1996).
- Singer, A. J., Clark, R. A. Cutaneous wound healing. N. Engl. J. Med. 341, 738-746 (1999).
- Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. Inflammation, stress, and diabetes. J. Clin. Invest. 115, 1111-1119 (2005).
- Weitzman, S. A., Gordon, L. I. Inflammation and cancer: role of phagocyte-generated oxidants in carcinogenesis. Blood. 76, 655-663 (1990).
- Ridker, P. M., Cushman, M., et al. Inflammation, aspirin, and the risk of cardiovascular disease in apparently healthy men. N. Engl. J. Med. 336, 973-979 (1997).
- Wyss-Coray, T., Mucke, L. Inflammation in neurodegenerative disease–a double-edged sword. Neuron. 35, 419-432 (2002).
- Hamilton, J. A. Colony-stimulating factors in inflammation and autoimmunity. Nat. Rev. Immunol. 8, 533-544 (2008).
- Harlan, J. M. Leukocyte-endothelial interactions. Blood. 65, 513-525 (1985).
- Bedard, K., Krause, K. H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology. Physiol. Rev. 87, 245-313 (2007).
- Rest, R. F., Spitznagel, J. K. Subcellular distribution of superoxide dismutases in human neutrophils. Influence of myeloperoxidase on the measurement of superoxide dismutase activity. Biochem. J. 166, 145-153 (1977).
- Hampton, M. B., Kettle, A. J., et al. Inside the neutrophil phagosome: oxidants, myeloperoxidase, and bacterial killing. Blood. 92, 3007-3017 (1998).
- Serhan, C. N., Savill, J. Resolution of inflammation: the beginning programs the end. Nat. Immunol. 6, 1191-1197 (2005).
- Jiang, F., Zhang, Y., et al. NADPH oxidase-mediated redox signaling: roles in cellular stress response, stress tolerance, and tissue repair. Pharmacol. Rev. 63, 218-242 (2011).
- Calafat, J., Kuijpers, T. W., et al. Evidence for small intracellular vesicles in human blood phagocytes containing cytochrome b558 and the adhesion molecule CD11b/CD18. Blood. 81, 3122-3129 (1993).
- Johansson, A., Jesaitis, A. J., et al. Different subcellular localization of cytochrome b and the dormant NADPH-oxidase in neutrophils and macrophages: effect on the production of reactive oxygen species during phagocytosis. Cell. Immunol. 161, 61-71 (1995).
- Kumar, A. P., Piedrafita, F. J., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma ligands regulate myeloperoxidase expression in macrophages by an estrogen-dependent mechanism involving the -463GA promoter polymorphism. J. Biol. Chem. 279, 8300-8315 (2004).
- Tseng, J. C., Kung, A. L. In vivo imaging of inflammatory phagocytes. Chem Biol. 19, 1199-1209 (2012).
- Gross, S., Gammon, S. T., et al. Bioluminescence imaging of myeloperoxidase activity in vivo. Nat. Med. 15, 455-461 (2009).
- Kielland, A., Blom, T., et al. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012. Free Radic. Biol. Med. 47, 760-766 (2009).
- Zhou, J., Tsai, Y. T., et al. Noninvasive assessment of localized inflammatory responses. Free Radic. Biol. Med. 52, 218-226 (2012).
- Karlsson, A., Nixon, J. B., et al. Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase. J. Leukoc. Biol. 67, 396-404 (2000).
- Taylor, R. G., McCall, C. E., et al. Histopathologic features of phorbol myristate acetate-induced lung injury. Lab Invest. 52, 61-70 (1985).
- Fukaya, S., Matsui, Y., et al. Overexpression of TNF-alpha-converting enzyme in fibroblasts augments dermal fibrosis after inflammation. Lab Invest. 93, 72-80 (2013).
- Lu, Y. C., Yeh, W. C., et al. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42, 145-151 (2008).
- Aitken, R. J., Buckingham, D. W., et al. Reactive oxygen species and human spermatozoa: analysis of the cellular mechanisms involved in luminol- and lucigenin-dependent chemiluminescence. J. Cell. Physiol. 151, 466-477 (1992).
- Allen, R. C., Loose, L. D. Phagocytic activation of a luminol-dependent chemiluminescence in rabbit alveolar and peritoneal macrophages. Biochem. Biophys. Res. Commun. 69, 245-252 (1976).
- Caldefie-Chezet, F., Walrand, S., et al. Is the neutrophil reactive oxygen species production measured by luminol and lucigenin chemiluminescence intra or extracellular? Comparison with DCFH-DA flow cytometry and cytochrome c reduction. Clin. Chim. Acta. 319, 9-17 (2002).
- Dahlgren, C., Aniansson, H., et al. Pattern of formylmethionyl-leucyl-phenylalanine-induced luminol- and lucigenin-dependent chemiluminescence in human neutrophils. Infect. Immun. 47, 326-328 (1985).
- Dahlgren, C., Karlsson, A. Respiratory burst in human neutrophils. J. Immunol. Methods. 232, 3-14 (1999).
- Aerts, C., Wallaert, B., et al. Release of superoxide anion by alveolar macrophages in pulmonary sarcoidosis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 465, 193-200 (1986).
- Zhang, N., Francis, K. P., et al. Enhanced detection of myeloperoxidase activity in deep tissues through luminescent excitation of near-infrared nanoparticles. Nat Med. , (2013).
