대규모 SNP 유전자형 응용 프로그램에 대한 Infinium 분석
Summary
프로토콜은 대규모 유전자형을 수행 Illumina 사 Infinium의 분석법을 사용하는 것이 기재되어있다. 이러한 분석은 안정적으로 사흘 만에 개인의 DNA 샘플의 수백에 걸쳐 수백만의 SNP 유전자형 수 있습니다. 일단 생성,이 유전자형이 다른 질병 또는 표현형의 다양한 연결을 확인하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
인간 게놈의 유전자형 변형 표현형과 유전 연결을 식별하는 효과적인 방법으로 입증되었습니다. 가족이나 집단 내의 변형의 분포는 질병의 유전 적 요인의 식별을 용이하게 할 수있다. 유전자형 BeadChips의 Illumina의의 패널 조사는 수천 또는 단일 염기 다형성의 수백만 (SNP를을) 유전자형하거나 DNA 샘플의 큰 숫자에서 같은 사본 수와 같은 다른 게놈 변이를 분석 할 수 있습니다. 이 SNP를 게놈으로 확산 될 가능성 발견을 극대화하기 위해 특정 지역에 타겟팅 할 수 있습니다. Infinium 분석 신속 고품질, 정확한 결과를 얻을 수 있도록 최적화되었다. 올바른 설정으로, 하나의 기술자가 배열의 종류에 따라, 주 수천에 DNA 샘플을 몇 백에서 처리 할 수 있습니다. 이 분석은 게놈 DNA로 시작하고 배열의 스캔으로 끝나는, 모든 단계를 통해 사용자를 안내합니다. 타당성 reage 사용국세청은, 샘플을 증폭, 조각, 침전 재현 탁, 스테인드 단일 기본, 연장 칩에 하이브리드 및 이스 칸 또는 하이 스캔 고해상도 광학 이미징 시스템 중 하나에서 검색합니다. 한 하룻밤 단계는 DNA를 증폭하는 데 필요합니다. DNA 변성과 등온 전체 게놈 증폭에 의해 증폭되고, 따라서, PCR이 필요하지 않습니다. 샘플은 두 번째 밤새 단계에서 배열에 하이브리드된다. 셋째 날에 의해, 샘플을 스캔하고 분석 할 준비가 된 것입니다. 증폭 된 DNA는 비드 배열함으로써 처리량을 최대화 모든 요일을 처리 할 수 있도록 다량 비축 될 수있다.
Introduction
단일 염기 다형성 (SNP를)를 입력하면 질환과 관련된 위험 변종을 식별하는 중요한 방법입니다. 역사적으로, 유전자형 실험의 범위는 가능한 기술에 의해 제한되었습니다. 겔 전기 영동 기반 유전자형 방법은 샘플 및 SNP 처리량으로 제한된다 [1]. 이러한 분석을 개발하는 것은 종종 최적화를위한 변형 주변 지역의 구성과 구조에 의존하는 노동 집약적 일 수있다 [1]. 생명 기술에 의해 개발의 TaqMan 유전자형 분석은, 신속하고 최소 기술자 개입 많은 샘플을 실행할 수있다 [2]하지만 SNP 멀티플렉싱 제한 일당 아니라 아래 백만 [3,4에 유전자형의 총 수를 제한하는 것을 계속 ]. 미만 백 SNP를 함께 다중화 될 수 Sequenom의 IPLEX 플랫폼은 또한, 한 번에 많은 샘플을 실행할 수 있지만, 처리량이 전체의 비교적 낮은 [5]. 베크만 쿨터의 SNP 스트림 기술이론적으로는 하루에 3 백만 유전자형을 생성 할 수 있지만, 반응 당 마흔 여덟의 SNP 최대이 기술의 한계 프로젝트 범위 [4,6]. GoldenGate는 분석은 샘플 당 SNP를 수백 또는 수천에 매일 거의 이백 DNA 샘플을 처리 할 수 있지만 한 번 [4,7에서 삼천의 SNP를 입력 할 때, 유전자형 당 가격은 고급, 매우 높은 처리량 기술과 경쟁하지 않습니다 ]. 하루 수백만 유전자형을 처리하기 위해 대규모 게놈 – 와이드 관련 연구에 필요한 치수는 어레이 혼성화 분석법은 시장에서 가장 비용 효율적인 옵션이되었다.
하이브리드 어레이의 어피 메트릭스의 라인과 Infinium 기반 배열의 Illumina의 라인은 샘플의 잠재적으로 수백 개의 병렬 [4,8]에서 SNP를 수천 또는 수백만의 수백에 입력 할 수 있습니다. 이들의 SNP는 전 등 관심 지역에서 지역화, 전체 게놈에 분산 될 수있다OMES, 또는 사용자의 취향에 맞게 사용자 정의. 이러한 배열은 정확하게 한 번에 샘플 당 만의 SNP 유전자형 할뿐만 아니라, 잠재적으로 발표 염색체 이상을 카피 수 변화를 측정 할 수있는 단지의 혜택이있다. Infinium 정렬 OMNI BeadChip 배열은 현재 하루에 약 백 개의 샘플에, 50 만 사용자 지정 궤적 등의 샘플 당 약 오백 만 마커까지 유전자형하는 기능이 있습니다.
대부분의 질환은 유전 적 요소를 가지고, 이러한 대규모 실험 질환과 관련된 유전자를 찾는 데 중요 할 수있다. 높은 처리량의 유전자형이 샘플의 효율적인 유전자형의 생성을 허용하는 것은 설득력 낮은 작은 대립 유전자 주파수에서 유전 연결을 감지하기에 충분히 큰 설정합니다. 전체 게놈 유전자형 프로젝트는 통계적으로 유의 한 환자 – 대조군의 대립 유전자 빈도 나 카피 수의 차이와 지역의 위치를 찾을 수 있습니다 [9,10,11]. 국가 인간 창에 따르면놈 연구소, 게놈 넓은 협회 연구는 P-1보다 작은 값 × 10 -5으로 8,283의 SNP의 발견에 따른 2008 년 11 월 25 일 및 2013년 1월 25일 사이에 1,490 별도의 서적을 주도 (http://를 참조 높이에서 게놈 전체 분석에 의해 제공 폭 넓은 접근 방식의 혜택 고환암에 이르기까지 조건을 연구 www.genome.gov/gwastudies/). 이러한 연구. 입력의 범위가 너무 제한적이었다 이러한 경우, 그 전체 지역 통지를 탈출 할 수 있습니다. 대규모 협회 분석에 따라서,, 게놈 전체의 유전자형 기술 선택의 기술입니다.
Infinium 분석의 다양한 버전은 각각 특정 유형의 어레이로 사용하는 것을 목적으로 존재한다. 또는 24 샘플 어레이 칩 – 아래 깊이에서 논의 InfiniumUltra 분석은, 많은 12에 적합합니다. 이들은 종종 DNA 샘플 당 십만 이상의 SNP를 유전자형과 t에 초점을이러한 엑솜 또는 사용자 정의 패널에 같은 argeted 지역. 다른 분석 버전은 전체 게놈 유전자형 배열과 같은 다른 칩 유형, 필요할 수 있습니다. 모든 Infinium 분석법은 공통 기준을 공유하고 주로 만 시약 이름, 시약 볼륨 또는 실 염색 시약 절차에 의해 다를 그러나 번 분석 버전에 완전히 기술들은 보편적으로 적용될 수있다. 이러한 메틸화 배열과 같은 다른 배열은 물론, 거의 – 동일한 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 케어 칩 유형 사용에 필요한 분석의 버전을 사용하는 경우에만주의해야한다. 이러한 유전자 발현 수준을 측정하는 것과 같은 일부 유형은, nonInfinium 프로토콜의 사용을 요구할 수있다.
샘플은 일괄 적으로 처리해야합니다. 예를 들어, InfiniumUltra 분석법으로, 예비 혼성화 시약 튜브는 96 샘플을 실행하기에 충분한 양을 포함하고, 튜브는 다시 냉동 될 수 없다. 따라서, 샘플은 한 번에 96 샘플의 일괄 처리로 실행해야합니다. 샘플은 전나무에 증폭 될 것이다T 날. benchwork 약 1 시간 후, 샘플 20 ~ 24 시간 동안 대류 오븐에서 가열되어야한다. 다음 날, 거의 4 시간이 침전하고, 샘플을 나중에 사용하기 위해 냉동 또는 칩에 하이브리드 될 수 있습니다 어느 시점에서 샘플을 재현 탁, 단편화를 소비한다. 칩을 넣기 샘플이 16 ~ 24 시간 동안 밤새 하이브리드 될 후, 약 2 시간 소요됩니다. 셋째 날, 염색 및 확장 단계 ~ 4 시간이 걸립니다. 추가 시간은 세척, 코팅, 그리고 칩을 건조 소요됩니다. 마지막으로, 배열은 사용 유형에 따라 15 ~ 60 분 / 칩에서 걸릴 수있는, 스캔됩니다.
표준 실험실의 안전과 청결주의 사항이 적용됩니다. 증폭 PCR 기반은 아니지만, 사전 및 postamplification 절차에 대해 별도의 워크 스테이션은 오염의 가능성을 최소화하기 위해 필요합니다. 사용중인 모든 장비 제공 시약의 식별 번호는 추적 시트에 로그온해야합니다. Reage국세청은 분배하기 전에 여러 번 사용하기 직전에 해동 반전해야한다. 입력되는 DNA는 표준 방법에 의해 단리 및 형광 분석기로 정량 고품질 게놈 DNA (280분의 260 1.6-2.0의 흡광도 비, 3.0 이하의 230분의 260 흡광도 비)이어야한다. DNA의 분해는 종종 낮은 품질의 분석 결과에 기여하는 요인이다. 이 금액은 어떤 칩 종류에 따라 다를 수 있지만 일반적으로 DNA 200 NG가 필요합니다. 테칸 액체 핸들링 로봇은 프로토콜의 여러 단계를 자동화하고 요인으로 인간의 오류를 최소화 할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
대형 유전자형 어플리케이션은 더 많은 인간 질병의 기초 유전 메커니즘을 이해하기 위해 사용되어왔다. 게놈 넓은 협회 분석을 통해 의미있는 변형의 발견은 추가 연구를 위해 후보 지역에 플래그를 할 수 있습니다. 또, 유전자형 데이터 시퀀싱 프로젝트의 품질 관리를위한 좋은 도구이다.
시료 처리량을 극대화하기 위해, 여러 개의 샘플 플레이트 증폭 단편적인, 재 부유 상태로 저장 될 수있다. 여덟 판은 여러 일괄 처리를위한 프로토콜의 첫 번째 24 시간을 결합하고 칩의 처리 ~ 2-8일에 대한 충분한 자료를 제공하고, 하루에 증폭 될 수있다. 증폭 된 플레이트를 미리 비축하고, 새로운 샘플을 스캐닝이 이전 실행에서 시작 직후 칩에 혼성화되는 경우, 처리는 추가적인 샘플 준비 동안 정지 할 필요없이 연속적으로 실행할 수있는 경우. 따라서, 비록 샘플 전체를 받아야하는 3 일 정도 걸릴 것입니다분석 데이터는 매일 발생 될 수있다. Assuming24 칩이 매일 처리되고, 5 일 근무제는 12 샘플 비드 칩에서 실행되는 1,000 이상 DNA 샘플 수 있습니다. 모든 단계 또는 시약이 실패하면 어떤 보정을 적용 할 수 있습니다 전에 그러나, 여러 일괄 처리 성능 저하에 대한 위험이있을 수 있습니다. 배열 스캔하거나 분석 할 때까지 오류 통지를 벗어날 수도, 처리량이 최대화되어있는 경우 따라서, 프로토콜의 다양한 단계에있는 수백 개의 샘플이 이미 발견시 같은 결함이 치료를 받고 있습니다. 분실 된 시약 및 데이터가 복구 될 수 없으므로, 사용자는 가속 플로에 대한 필요성에 대해 이러한 위험을 계량한다.
GenomeStudio 분석 소프트웨어 진정 유전자형 프로세스의 성공을 측정하는 제 기회이다. 규범 세타 강도 플롯 대 규격-R이 제대로 클러스터 된 경우이 값이 SLI 다르지만, 샘플의 평균 통화 비율 (전체의 SNP %가 성공적으로 입력), 99 %를 접근해야ghtly 배열 유형에 따라 다릅니다. 85-90%보다 낮은 전화 요금과 함께 모든 샘플의 데이터는 신뢰할 수없는 폐기해야합니다. 품질 관리 목적으로, 결과는 가능한 이전에 공지 된 유전자형마다에 비교되어야한다. 이러한 데이터가 존재하지 않는 경우는, 의도적 샘플 중복 판 또는 배열 게재 위치를 확인하는 유용한 도구입니다. 이러한 중복 쌍은 별도의 칩, 접시, 배치, 또는 프로젝트에 배치해야합니다, 그들의 유전자형 세대에 확인. 특정 QC 제약 연구자의 취향에 따라 다양하지만, 일반적인 SNP 제약은 샘플 호출 성공, 하디 – 와인버그 평형, 또는 케이스 및 컨트롤 사이 missingness을 기반으로하는 일반적인 샘플 제약은 전화 요금, 멘델의 불일치, 또는 상호 참조를 기반으로하면서 임상 성 데이터에 대한 X-염색체의 이형 접합의 [13].
어떤 문제가 발생하면, 분석 제품군에있는 컨트롤 대시 보드는에 제출 될 수있다원인을 확인하기 위해 회사. 이러한 컨트롤은 종종 확률이 높은 단계 또는 시약 실패 문제를 좁힐 수 있습니다. 그 중 하나의 SNP가 Infinium의 유전자형 실험을 통해 발견하는 경우, 자신의 강도 플롯 재확인 추가 연구가 수행되기 전에 클러스터링 오류 GenomeStudio에 있어야합니다.
실패 Infinium의 유전자형 실험으로 인해 인간의 처리 오류 또는 품질이 낮은 입력 DNA 가능성이있다. 샘플 정량화 정확하고 정확해야합니다. 최상의 결과를 위해, 모든 시약은 시료에 추가 또는 칩은 프로토콜에 의해 볼륨 세트에 분배해야합니다. 피펫은 올바르게 조정해야합니다. 시약 만료 후 실행할 수 없습니다 한 번 해동 다시 냉동하지 말아야 RA1 시약 저장. 가능한 염색 및 확장 오류를 최소화하기 위하여, 포름 아미드 / EDTA 혼합물을 매월 신선한 준비되어야한다. 모두 -20 ° C 시약은 수동 제상 냉동고에 보관해야합니다. 명세서에 사용 된 모든 실험기구aining, 프로토콜의 확장 및 세척 부분은 즉시 폐기에 물과 중성 세제로 깨끗이 세척해야한다. HYB 실 가습 저수지 테스트 튜브 브러시와 중성 세제로 세정해야한다. 일주일에 한 번, 자신의 사용 설명서의 지시에 따라 유리 슬라이드는 10 % 표백제로 세척해야한다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품에 대한 자금 지원은 NIH P20 GM103456, NIH RC2 AR058959, 그리고 NIH R56 AI063274에 의해 제공되었다
Materials
| Consumable or Equipment | Manufacturer | Part Number | Minimum Required for 96 Samples |
| 0.8 ml Deep Well Plate | Thermo Scientific | AB-0765 | 1 |
| Plate Mats | Thermo Scientific | AB-0674 | 2 |
| Reagent Basin | Fisher Scientific | 13-681-502 | 9 |
| Heat-seal Sheets | Thermo Scientific | AB-0559 | 1 |
| Flow-through Spacer | Fisher Scientific | NC9563984 | 6 |
| Pipette tips – 200 μl | Rainin | GP-L200F | 192 |
| Pipette tips – 10 μl | Rainin | GP-L10F | 16 |
| Pipette tips – 1,000 μl | Rainin | GP-L1000F | 16 |
| DNA Suspension Buffer | Teknova | T0220 | 0.5 ml |
| 0.1 N NaOH | Fisher Scientific | AC12419-0010 | 0.5 ml |
| Isopropanol (HPLC grade) | Fisher Scientific | A451 | 15 ml |
| Ethanol (200-proof) | Sigma-Aldrich | 459836 | 330 ml |
| Formamide (100%) | Thomas Scientific | C001K38 | 15 ml |
| EDTA (0.5 M) | Amresco | E177 | 0.2 ml |
| 10 μl 8-channel Pipette | Rainin | L8-10XLS | 1 |
| 200 μl 8-channel Pipette | Rainin | L8-200XLS | 2 |
| 1,000 μl Single-channel Pipette | Rainin | L-1000XLS | 1 |
| Microplate Shaker | VWR | 13500-890 | 1 |
| Refrigerated Microplate Centrifuge | VWR | BK369434 | 1 |
| Hybridization Oven | Illumina | SE-901-1001 | 1 |
| Hybex Microsample Incubator | SciGene | 1057-30-0 | 1 |
| Hybex MIDI Heat Block Insert | Illumina | BD-60-601 | 1 |
| Heat Sealer | Thermo Scientific | AB-0384 | 1 |
| Hyb Chamber w/ Insert and Mat | Illumina | BD-60-402 | 2 |
| Surgical Scissors | Fisher Scientific | 13-804-20 | 1 |
| Flow Through Assembly Parts | Illumina | WG-10-202 | 8 |
| Wash Rack and Dish | Illumina | BD-60-450 | 1 |
| Genepaint Chamber Rack | Tecan | 760-800 | 1 |
| Temperature Probe | Illumina | A1-99-109 | 1 |
| Staining Rack and Dish | Illumina | WG-10-207 | 1 |
| Self-Closing Tweezers | Ted Pella, Inc | 5374-NM | 1 |
| Vacuum Manifold | Ted Pella, Inc | 2240 | 1 |
| iScan or HiScan | Illumina | – | 1 |
References
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