Infinium Assay voor grootschalige SNP genotypering Toepassingen
Summary
Een protocol wordt beschreven dat Illumina Infinium assays gebruikt om grootschalige genotypering uitgevoerd. Deze testen betrouwbaar kan genotype miljoenen SNPs over honderden individuele DNA-monsters in drie dagen. Eenmaal gegenereerd, kunnen deze genotypes worden gebruikt om te controleren associaties met verschillende ziekten of fenotypes.
Abstract
Genotypering varianten in het menselijk genoom blijkt een efficiënte methode om genetische associaties identificeren fenotypes zijn. De verdeling van de varianten in families of populaties kan identificatie van het genetische factoren van ziekten vergemakkelijken. Panel Illumina van genotypering BeadChips kunnen onderzoekers duizenden of miljoenen single nucleotide polymorfismen (SNP's) genotype of andere genomische varianten, zoals het aantal kopieën, over een groot aantal DNA-monsters te analyseren. Deze SNPs kunnen worden verspreid over het genoom of gerichte in specifieke regio om mogelijke ontdekking maximaliseren. De Infinium test is geoptimaliseerd voor hoge kwaliteit, nauwkeurige resultaten snel opleveren. Bij juiste instelling kan een enkele technicus verwerken van enkele honderden tot meer dan duizend DNA monsters per week, afhankelijk van het type array. Deze test helpt gebruikers bij elke stap, vanaf genomisch DNA en eindigend met het scannen van de matrix. Met behulp van fatsoen Reagegen worden monsters versterkt, gefragmenteerd, neergeslagen, opnieuw gesuspendeerd, gehybridiseerd met de chip, verlengd met een enkele base, gekleurd, en gescand op ofwel een iScan of Hi Scan hoge-resolutie optische imaging systeem. Een overnight stap is nodig om het DNA te amplificeren. Het DNA wordt gedenatureerd en isotherm geamplificeerd door geheel-genoom amplificatie, daarom is er geen PCR vereist. Monsters worden gehybridiseerd met de arrays in een tweede stap nachts. Op de derde dag, de monsters zijn klaar om te worden gescand en geanalyseerd. Geamplificeerde DNA kan worden opgeslagen in grote hoeveelheden, waardoor korrelarrays elke dag van de week te verwerken, daarbij maximaal debiet.
Introduction
Het typen van single nucleotide polymorfismen (SNP's) is een belangrijke methode voor het identificeren risico varianten geassocieerd met de ziekte. Historisch gezien is de reikwijdte van de genotypering experimenten beperkt door de beschikbare technologie. Gel elektroforese gebaseerde genotyperingsmethoden zijn beperkt in monster-en SNP-throughput [1]. Het ontwikkelen van deze testen kunnen vaak arbeidsintensief zijn, een beroep op de make-up en de structuur van de regio rond de variant voor de optimalisatie [1]. TaqMan genotypering assays ontwikkeld door Life Technologies, kan een groot aantal monsters snel en met minimale technicus betrokkenheid werking [2], maar SNP multiplexen beperkingen blijft het totale aantal genotypen beperken tot ruim onder de een miljoen per dag [3,4 ]. Sequenom Iplex platform kan ook draaien vele monsters in een keer, maar, aangezien minder dan honderd SNPs samen kunnen worden multiplexed, throughput is relatief lage algemene [5]. Beckman Coulter's SNP stroom technologietheoretisch produceren meer dan 3.000.000 genotypen per dag, maar dit technologische grenzen project bereik slechts maximaal achtenveertig SNPs per reactie [4,6]. Terwijl de GoldenGate assay bijna tweehonderd DNA-monsters per dag kan verwerken op honderden of duizenden SNPs per monster, de prijs per genotype is niet concurrerend met geavanceerde, ultra-high-throughput technieken bij het typen meer dan drieduizend SNPs tegelijk [4,7 ]. Om enkele miljoenen genotypes per dag verwerken, de schaal die nodig is voor grote genoom-brede associatie studies, array-hybridisatietesten zijn geworden van de meest kosteneffectieve optie op de markt.
Affymetrix's lijn van hybridisatie arrays en Illumina's lijn van Infinium-gebaseerde arrays staan mogelijk honderden samples op honderdduizenden of miljoenen SNPs worden ingetypt in parallel [4,8]. Deze SNP's kunnen worden verspreid over het hele genoom, gelokaliseerd in de regio's van belang, zoals exOMES, of aangepast aan de voorkeur van de gebruiker. Deze arrays hebben het voordeel niet alleen in staat om nauwkeurig genotype een miljoen SNPs per monster tegelijk, maar ook copy number variation meten mogelijk onthulling chromosomale abnormaliteiten. Infinium uitgelijnd OMNI BeadChip arrays hebben momenteel de mogelijkheid om elke dag genotype tot bijna vijf miljoen markers per monster, met inbegrip van een half miljoen aangepaste loci, op tot bijna honderd monsters.
Aangezien de meeste ziekten hebben een genetische component, kunnen deze grootschalige experimenten cruciaal bij het vinden genen geassocieerd met ziekte. High-throughput genotypering zorgt voor een efficiënte genotype generatie steekproef zet groot genoeg is om overtuigend te sporen genetische associatie bij lagere minor allel frequenties. Hele genoom genotypering projecten kan worden gebruikt om gebieden te lokaliseren met statistisch significante case-control allel frequentie of aantal kopieën verschillen [9,10,11]. Volgens de National Human Genome Research Institute, genoom-brede associatie studies hebben geleid tot 1.490 afzonderlijke publicaties tussen 25 november 2008 en 25 januari 2013, als gevolg van de ontdekking van 8283 SNPs met een p-waarde van minder dan 1 x 10 -5 (zie http:// www.genome.gov/gwastudies/). Deze studies, die aandoeningen, variërend van hoogte naar teelbalkanker, profiteerde van de brede benadering wordt geboden door een genoom-brede analyse onderzocht. In gevallen zoals deze, kunnen hele regio's van belang aandacht ontsnapten was de reikwijdte van het typen te beperkend geweest. Aldus voor grootschalige associatietesten, een genoom-brede genotypering techniek is de techniek van keuze.
Verschillende versies van de Infinium test bestaat, elk bestemd voor gebruik met bepaalde typen arrays. De InfiniumUltra assay, besproken in de diepte beneden, is geschikt voor vele 12 – of 24-monsterarray chips. Deze vaak genotype meer dan honderdduizend SNPs per DNA-monster en de focus op targeted regio's, zoals op exome of aangepaste panelen. Andere assay versies kunnen worden tot andere soorten chips, zoals de hele genoom genotypering arrays. Echter, zoals alle Infinium assays delen een gemeenschappelijke basis en vooral verschillen alleen door het reagens namen, het reagens volumes, of de exacte kleuring reagens procedure, technieken geperfectioneerd aan een test versie kan vaak worden universeel toegepast. Andere arrays, zoals methylatie arrays, kan een nagenoeg identieke protocol, ook. Zorg moet worden genomen om alleen de versie van de test voor het soort chip gebruikt. Sommige soorten, zoals degenen meten van genexpressie niveau, zou het gebruik van een nonInfinium protocol nodig.
De monsters moeten worden verwerkt in batches. Bijvoorbeeld, de InfiniumUltra test prehybridisatie reageerbuizen bevatten voldoende volume 96 monsters uitgevoerd en de buizen niet worden ingevroren. Derhalve moeten monsters worden uitgevoerd in partijen van 96 monsters tegelijk. De monsters worden versterkt op de sparrent dag. Na ongeveer 1 uur van benchwork moeten de monsters in een convectieoven gedurende 20-24 uur verwarmd. De volgende dag, ongeveer 4 uur worden besteed fragmenteren, neerslaan, en resuspenderen van de monsters, waarna de monsters kunnen ofwel worden ingevroren voor toekomstig gebruik of gehybridiseerd met de chip. Laden chips duurt bijna 2 uur, waarna de monsters worden 's nachts gehybridiseerd gedurende 16-24 uur. Op de derde dag, de kleuring en uitbreiding stap duurt ongeveer 4 uur. Een verdere uur wordt besteed wassen, coaten en drogen van de chips. Tenslotte worden de arrays gescand, waarbij rekening kan 15-60 min / chip, afhankelijk van het gebruikte type.
Standaard laboratorium veiligheid en netheid voorzorgsmaatregelen toe te passen. Hoewel de amplificatie niet op PCR gebaseerde, afzonderlijke werkstations voor pre-en postamplification procedures nodig zijn om kans op besmetting te minimaliseren. Het identificatienummer van elk-kit geleverd reagens in gebruik moet aangemeld zijn een tracking vel. Reagegen moet worden vlak voor gebruik een paar keer voorafgaand aan de uitgifte ontdooid en omgekeerd. Het DNA worden ingetypt moeten hoogwaardige genomische DNA (260/280 absorptie verhouding van 1,6-2,0, 260/230 absorptie ratio onder 3.0), geïsoleerd door middel van standaard methoden en gekwantificeerd met een fluorometer zijn. Afbraak van DNA vaak een bijdragende factor in lage kwaliteit testresultaten. Doorgaans wordt 200 ng DNA nodig, maar dit bedrag kan variëren voor bepaalde soorten chip. Een Tecan-liquid handling robot kan vele stappen van het protocol te automatiseren en het minimaliseren van menselijke fouten als een factor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Grootschalige genotypering toepassingen zijn gebruikt om beter inzicht in de genetische mechanisme achter vele menselijke ziekten. De ontdekking van een belangrijke variant via een genoom-brede associatie analyse kan een kandidaat regio vlag voor verdere studie. Daarnaast genotype data is een goed hulpmiddel voor de kwaliteitscontrole op sequencing projecten.
Om sample throughput te maximaliseren, kunnen meerdere monster platen worden versterkt en opgeslagen in hun gefragmenteerde, geresuspendeerde staten. Acht plaatjes worden geamplificeerd in een enkele dag combineert de eerste 24 uur van het protocol voor meerdere partijen en bieden genoeg materiaal voor ~ 2-8 dagen chip-processing. Als versterkte platen van tevoren worden opgeslagen, en als er nieuwe monsters worden gehybridiseerd met chips onmiddellijk na het scannen begint op de vorige run, kan de verwerking continu draaien zonder de noodzaak om te pauzeren voor extra monster voorbereiding. Daarom zal al monsters drie dagen om de volledige ondergaantest kunnen gegevens dagelijks gegenereerd. Assuming24 chips worden dagelijks verwerkt, een 5 daagse werkweek zorgt voor meer dan 1000 DNA-monsters te worden uitgevoerd op een 12-sample kraal chip. Als een trede of een reagens is mislukt echter meerdere batches mogelijk gevaar lopen voor de slechte prestaties voordat een correctie kan worden toegepast. Fouten kunnen onopgemerkt totdat de arrays worden gescand of geanalyseerd, daarom, als throughput gemaximaliseerd, honderden monsters in verschillende stadia van het protocol zou al hebben dezelfde gebrekkige behandeling bij ontdekking ontvangen. Als verloren reagentia en de gegevens niet kunnen worden hersteld, moet de gebruiker deze risico's af te wegen tegen de noodzaak van een versnelde workflow.
De GenomeStudio analyse software is de eerste kans om het succes van het genotyperingsproces werkelijk meten. Als de Norm-R vs Norm-Theta intensiteit percelen goed zijn geclusterd, moet de gemiddelde call rate (percentage van de totale SNPs succes getypt) van de monsters te benaderen 99%, hoewel deze waarde varieert slightly afhankelijk van het type array. De gegevens van een monster met een oproep lager tarief dan 85-90% is niet betrouwbaar en moet worden weggegooid. Voor kwaliteitscontrole doeleinden, moeten de resultaten worden vergeleken met een eerder bekende mogelijke genotypen wanneer. Als de gegevens bestaan, opzettelijke monster duplicatie is een nuttig hulpmiddel bij de controle van plaat of matrix plaatsingen. Deze dubbele paren moeten op aparte chips, borden, batches, of projecten worden geplaatst; hun genotypen gecontroleerd op generatie. Terwijl specifieke QC beperkingen variëren naar gelang de voorkeur van de onderzoeker, zijn gemeenschappelijke SNP beperkingen op basis van steekproefsgewijze oproep succes, Hardy-Weinberg evenwicht, of onvolledigheid tussen patiënten en controles, terwijl gemeenschappelijke steekproef beperkingen zijn gebaseerd op de beltarieven, Mendeliaanse inconsistenties of kruisverwijzingen X-chromosoom heterozygositeit klinische sekse gegevens [13].
Als zich een probleem voordoet, de Controls Dashboard, gevonden in de analyse suite, kan worden aan de ingediendebedrijf om oorzaak te bepalen. Deze controles kunnen vaak een beperking van de vraag naar de meest waarschijnlijke stap of reagens mislukking. Als een SNP's van belang zijn te vinden via een Infinium genotypering experiment, moeten hun intensiteit plots dubbel gecontroleerd in GenomeStudio voor clustering fouten voordat verder onderzoek wordt uitgevoerd zijn.
Een mislukte Infinium genotypering experiment is waarschijnlijk te wijten aan menselijke fout bij het verwerken of slechte kwaliteit ingang DNA. Monster kwantificering moeten accuraat en nauwkeurig zijn. Voor het beste resultaat, elke reagentia toegevoegd aan een monster of chip moet worden afgegeven bij de door het protocol ingestelde volume. Pipetten moeten behoren te worden geijkt. Reagentia moeten niet worden uitgevoerd na verloop en mag niet worden ingevroren eenmaal ontdooid, behalve de RA1 reagens. Om eventuele vlekken en uitbreiding fouten te minimaliseren, dient de formamide / EDTA mengsel vers bereid elke maand. Alle -20 ° C reagentia moeten worden opgeslagen in uitsluitend handmatige ontdooiing vriezers. Alle labware gebruikt in de staining, uitbreiding, en wassen delen van het protocol moet grondig worden gespoeld met water en een mild reinigingsmiddel onmiddellijk na onbruik. Het bevochtigen reservoirs in de hyb kamer moet worden geschrobd met een reageerbuis borstel en een mild schoonmaakmiddel. De glasplaatjes moet worden gewassen met 10% bleekmiddel, zoals geïnstrueerd door hun gebruikershandleidingen, een keer per week.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De financiering voor dit werk is verstrekt door NIH P20 GM103456, NIH RC2 AR058959 en NIH R56 AI063274
Materials
| Consumable or Equipment | Manufacturer | Part Number | Minimum Required for 96 Samples |
| 0.8 ml Deep Well Plate | Thermo Scientific | AB-0765 | 1 |
| Plate Mats | Thermo Scientific | AB-0674 | 2 |
| Reagent Basin | Fisher Scientific | 13-681-502 | 9 |
| Heat-seal Sheets | Thermo Scientific | AB-0559 | 1 |
| Flow-through Spacer | Fisher Scientific | NC9563984 | 6 |
| Pipette tips – 200 μl | Rainin | GP-L200F | 192 |
| Pipette tips – 10 μl | Rainin | GP-L10F | 16 |
| Pipette tips – 1,000 μl | Rainin | GP-L1000F | 16 |
| DNA Suspension Buffer | Teknova | T0220 | 0.5 ml |
| 0.1 N NaOH | Fisher Scientific | AC12419-0010 | 0.5 ml |
| Isopropanol (HPLC grade) | Fisher Scientific | A451 | 15 ml |
| Ethanol (200-proof) | Sigma-Aldrich | 459836 | 330 ml |
| Formamide (100%) | Thomas Scientific | C001K38 | 15 ml |
| EDTA (0.5 M) | Amresco | E177 | 0.2 ml |
| 10 μl 8-channel Pipette | Rainin | L8-10XLS | 1 |
| 200 μl 8-channel Pipette | Rainin | L8-200XLS | 2 |
| 1,000 μl Single-channel Pipette | Rainin | L-1000XLS | 1 |
| Microplate Shaker | VWR | 13500-890 | 1 |
| Refrigerated Microplate Centrifuge | VWR | BK369434 | 1 |
| Hybridization Oven | Illumina | SE-901-1001 | 1 |
| Hybex Microsample Incubator | SciGene | 1057-30-0 | 1 |
| Hybex MIDI Heat Block Insert | Illumina | BD-60-601 | 1 |
| Heat Sealer | Thermo Scientific | AB-0384 | 1 |
| Hyb Chamber w/ Insert and Mat | Illumina | BD-60-402 | 2 |
| Surgical Scissors | Fisher Scientific | 13-804-20 | 1 |
| Flow Through Assembly Parts | Illumina | WG-10-202 | 8 |
| Wash Rack and Dish | Illumina | BD-60-450 | 1 |
| Genepaint Chamber Rack | Tecan | 760-800 | 1 |
| Temperature Probe | Illumina | A1-99-109 | 1 |
| Staining Rack and Dish | Illumina | WG-10-207 | 1 |
| Self-Closing Tweezers | Ted Pella, Inc | 5374-NM | 1 |
| Vacuum Manifold | Ted Pella, Inc | 2240 | 1 |
| iScan or HiScan | Illumina | – | 1 |
References
- Shi, M. M. Enabling large-scale pharmacogenetic studies by high-throughput mutation detection and genotyping technologies. Clin. Chem. 47 (2), 164-172 (2001).
- Livak, K. J. SNP genotyping by the 5′-nuclease reaction. Methods Mol. Biol. 212, 129-148 (2003).
- Seeb, J. E., Pascal, C. E., Ramakrishnan, R., Seeb, L. W. SNP genotyping by the 5′-nuclease reaction: advances in high throughput genotyping with non-model organisms. Methods in Mol. Biol. 578, 277-292 (2009).
- Bayés, M., Gut, I. G., ed, . Overview of Genotyping. Molecular Analysis and Genome Discovery. , 1-23 (2011).
- Lee, Y., Seifert, S. N., Fornadel, C. M., Norris, D. E., Lanzaro, G. C. Single-Nucleotide Polymorphisms for High-Throughput Genotyping of Anopheles arabiensis in East and Southern Africa. J. Med. Entomol. 49 (2), 307-315 (2012).
- Liu, Z. SNP Genotyping Platforms. Next generation sequencing and whole genome selection in aquaculture. , 123-132 (2011).
- Shen, R., Fan, J. B., et al. High-throughput SNP genotyping on universal bead arrays. Mutat. Res./Fundam and Mol. Mech. of Mutagenesis. 573 (1), 70-82 (2005).
- Ragoussis, J. Genotyping technologies for all. Drug Discov. Today: Technol. 3 (2), 115-122 (2006).
- Wu, C. C., Shete, S., Jo, E. J., et al. Whole-Genome Detection of Disease-Associated Deletions or Excess Homozygosity in a Case-Control Study of Rheumatoid Arthritis. Hum. Mol. Genet. , (2012).
- Green, E. K., Hamshere, M., Forty, L., et al. Replication of bipolar disorder susceptibility alleles and identification of two novel genome-wide significant associations in a new bipolar disorder case-control sample. Mol. Psychiatry. , (2012).
- Shete, S., Hosking, F. J., Robertson, L. B., et al. Genome-wide association study identifies five susceptibility loci for glioma. Nat. Genet. 41 (8), 899-904 (2009).
- Inc Illumina. . Infinium HD Ultra User Guide 11328087 RevB-1. , 15-101 (2009).
- Turner, S., Armstrong, L. o. r. e. n. L., Yuki Bradford, ., et al. Quality Control Procedures for Genome Wide Association Studies. Curr Protoc Hum Genet. , 1-19 (2011).
