Nicel<em> In vitro</emStatik Koşullarında Account İlköğretim İnsan mikrovasküler endotel hücreleri için Nötrofil yapışma Tedbir> Testi
Summary
Enfeksiyon bölgelerinde aktif endotele nötrofil bağlılık konağın inflamatuvar yanıt ayrılmaz bir bileşenidir. Için izin veren bir nötrofil bağlayıcı bir testtir Bu raporda açıklanan<em> In vitro</emStatik şartlar altında yangı ile aktive endotel hücrelerine bağlanan primer insan nötrofil> kantitasyonu.
Abstract
Vasküler endotel inflamatuvar yanıt olarak ayrılmaz bir rol oynar. Inflamasyon akut aşamasında, endotel hücreleri (EC) ana bilgisayar arabulucular veya doğrudan korunmuş mikrobiyal bileşenler veya ana-türetilmiş tehlike moleküller tarafından aktive edilir. Aktif EC ifade sitokinler, harekete kemokin ve adezyon molekülleri, enfeksiyon veya yaralanma yerinde lökosit etkinleştirmek ve korumak. Nötrofiller gelmesi ilk lökosit vardır ve her ikisi de hücrelerin yüzeyleri üzerinde mevcut yapışma molekülleri çeşitli yoluyla endotele bağlı. Nötrofil ana fonksiyonları doğrudan, mikrobiyal tehditleri ortadan kaldırmak ek faktörler serbest bırakılması yoluyla diğer lökositlerin teşvik ve yara tamir başlatmak için vardır. Bu nedenle, endotel onların işe alma ve eki inflamatuar yanıtın başlamasında önemli bir adımdır. Bu yazıda kullanarak in vitro nötrofil yapışma deneyi tarifCalcein statik şartlar altında mikrovasküler endotelyal hücre aktivasyonu ölçüde miktarını belirlemek için, birincil insan nötrofil AM-etiketli. Bu yöntem, floresan spektrofotometre ile ölçülmüştür aynı numuneleri, aynı zamanda doğrudan nötrofil bağlanmasının daha niteliksel değerlendirmesi için floresan mikroskobu kullanılarak görüntülendi edilebilir ek bir avantaja sahiptir.
Introduction
Vasküler endotel dolaşan kan ile doğrudan temas halinde olduğu için, bu benzersiz enfeksiyon veya yaralanma sırasında hızlı bir inflamatuvar yanıt başlatmak için yer almaktadır. Endotel hücreleri (EC) korunmuş bakteriyel bileşenleri ve tehlike moleküllerin çeşitli tanımak ifade örüntü tanıma reseptörleri ve bu TNF gibi ev sahibi yangı için reseptörleri. Bu reseptörlerin aktivasyonu EC sitokinler (örn., IL-6, IL-8, CXCL1 ve CCL2) salgılamaya ve hücrenin yüzeyinde 1 yapışma molekülleri (örneğin, E / P-selektin, VCAM-1 ve ICAM-1) upregüle indükler , 2. Bu moleküller tüm bulaşıcı ajanların ev sahibi açık ve doku onarımı 3,4 başlatmak için enfeksiyon ve yaralanma sitelere lökositlerin lokalizasyonu kolaylaştırmak. Enfeksiyona nötrofil yanıtı vasküler endotel ve yanıt arasında iyi koordine etkileşim içerir nötrofil. EM aktivasyonu üzerine, IL-8 salgılanan ve enfeksiyon veya yaralanma 5,6 siteye ev için nötrofil sağlar endotel üzerindeki bir damar içi degrade oluşturur. E / P-selektinler aracılık nötrofil yakalama ve nötrofil hücre yüzeyinde glycomolecules ile nispeten zayıf dernekleri aracılığıyla haddeleme. Bu etkileşimler, bununla aynı soydan gelen reseptörlere IL-8, bağlayıcı ile birlikte, sağlam, integrin-aracılı bağlanma ve endotel hücre yüzeyi 7-10 nötrofil nihai durması kolaylaştırır. Tutuklanmasından sonra, nötrofil doğrudan, patojenlerin ortadan kaldırmak patojenlerin yayılmasını önlemek için nötrofil hücre dışı tuzaklar oluşturmak, yaraların iyileşmesini sağlar ve bu monositler, makrofajlar ve dendritik gibi diğer lökosit işe ek faktörler serbest bırakmak için enfeksiyon belirli sitelere damar dışına geçirebilirsiniz hücreleri 11-17.
Microv için nötrofil bağlılık ölçmek için bir in vitro bir yöntemdir Bu raporda açıklananascular TNF ev sahibi inflamatuar arabulucu tarafından aktif hale ECS. Bu deney, EC aktivasyonu, ve nötrofil değerlendirmek için tasarlanmıştır. Birincil insan nötrofil ilk yoğunluk gradiyenti ayırma kullanılarak izole, ve sonra Calcein asetoksimetil (AM) ile etiketlenir. Canlı hücreler hidrolize Calcein içinde esteraz 492-495 nm ve 513-516 nm 18 emisyon bir uyarma ile yüksek floresan Calcein molekülüne var. Floresan etiketli nötrofil sonra EM mono tabakaları ile inkübe edilir ve yapışkan olmayan nötrofil sonradan kaldırılır. Geriye kalan, bağlı nötrofil floresan sonra bir floresan spektrofotometre kullanılarak ölçülmüştür ve oyuk başına toplam nötrofil floresan girişi bir yüzdesi olarak hesaplanır. Bu yöntem spektrofotometre kullanılan bağlı Calcein-etiketli nötrofil doğrudan AB ac okumak daha nitel vermek için floresan mikroskobu kullanılarak görüntülendi olabilir ek bir avantaja sahiptirtivasyon. Bu testte statik şartlar altında gerçekleştirilir, çünkü nötrofil yapışma kaskad ortaya yalnızca çok ilk olayların değerlendirilecektir. Bu TNF ile tedavi edilen insan akciğer mikrovasküler EC (HMVEC-Akciğer) bu nötrofil bağlılık E-selektin ile etkileşim bozulur zaman mono tabakaları büyük ölçüde azalır göstermek için E-selektin engelleme antikorlar kullanarak bu raporda teyit edilir.
TNF ek olarak, başarıyla Toll-benzeri reseptör 1/2 agonistleri peptidoglikan ile ilişkili lipoprotein (PAL), murein lipoprotein (MLP) ve Pam3Cys ve insan umbilikal ven EC (HUVEC) aktivasyon boyutunu belirlemek için bu testte kullanmış Pam3Cys 19,20 ile HMVEC-Akciğer aktivasyonu. Buna ek olarak, başarılı bir şekilde bu metodoloji bir çeşitliliği ile uyumlu olduğunu düşündürmektedir, kinaz inhibitörleri ile ve HMVEC-Akciğer yüzeyi ve sitoplazmik proteinlerin RNAi aracılı demonte sonra bu testte kullanılabilir ve biyokimyasal screening deneyleri 20. Özetle, bu testte in vitro yangı tarafından EC aktivasyon ölçüde erişmek için, tekrarlanabilir, daha işlevsel şekilde kullanmak için kolay sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Başarılı bir nötrofil / mikrovasküler endotelyal hücre yapışma deneyi için en kritik adımlar şunlardır: 1) düşük geçiş sayısı (<9), sağlıklı endotel hücreleri kullanarak, bir düşük yoğunluklu (yani <5 x 10 6 hücre izole edilmiş nötrofiller bakımı 2) / ml) ve izolasyon iki saat içinde bunları kullanarak, sırasıyla, ve 3) titiz Kalsein-etiketli nötrofillerin yıkama ve nötrofillerden kalsein EC kirlenme ve kaybını en aza indirmek için bir zamanında Kalsei…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Anestezi ve Perioperatif Bakım ucsf Bakanlığı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| HMVEC-Lung | Lonza | CC-2527 | |
| EGM-2 MV | Lonza | CC-3202 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175-095 | Can be substituted with any vendor |
| 48-well Tissue Culture Plates | BD Falcon | 353078 | |
| PBS (without phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL001 | Can be substituted with any vendor |
| D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | Can be substituted with any vendor |
| RPMI-1640 (without phenol red) | Life Technologies | 11835-030 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield | 1114683 | |
| calcein AM | Life Technologies | C3099 | (0.995 mM) stock soln |
| Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 40 μM filters | VWR | 21008-949 | Can be substituted with any vendor |
| FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer | BMG LABTECH | – |
References
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Collins, T., et al. Transcriptional regulation of endothelial cell adhesion molecules: NF-kappa B and cytokine-inducible enhancers. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 9, 899-909 (1995).
- Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
- Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
- Middleton, J., et al. Transcytosis and surface presentation of IL-8 by venular endothelial cells. Cell. 91, 385-395 (1997).
- Rot, A. Endothelial cell binding of NAP-1/IL-8: role in neutrophil emigration. Immunol. Today. 13, 291-294 (1992).
- Detmers, P. A., et al. Neutrophil-activating protein 1/interleukin 8 stimulates the binding activity of the leukocyte adhesion receptor CD11b/CD18 on human neutrophils. J. Exp. Med. 171, 1155-1162 (1990).
- Laudanna, C., Kim, J. Y., Constantin, G., Butcher, E. Rapid leukocyte integrin activation by chemokines. Immunol. Rev. 186, 37-46 (2002).
- Simon, S. I., Hu, Y., Vestweber, D., Smith, C. W. Neutrophil tethering on E-selectin activates beta 2 integrin binding to ICAM-1 through a mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway. J. Immunol. 164, 4348-4358 (2000).
- Zarbock, A., Ley, K. Mechanisms and consequences of neutrophil interaction with the endothelium. The American Journal of Pathology. 172, 1-7 (2008).
- Muller, W. A. Mechanisms of leukocyte transendothelial migration. Annu. Rev. Pathol. 6, 323-344 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. International Immunopharmacology. 10, 1325-1334 (2010).
- McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330, 362-366 (2010).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
- Soehnlein, O., Lindbom, L., Weber, C. Mechanisms underlying neutrophil-mediated monocyte recruitment. Blood. 114, 4613-4623 (2009).
- Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Prakash, A., Xu, F., Hellman, J. Activation of endothelial TLR2 by bacterial lipoprotein upregulates proteins specific for the neutrophil response. Innate Immun. 18, 602-616 (2012).
- Haugland, R. P., Johnson, I. D., Basey, A. . The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labelling Technologies. , (2005).
- Shin, H. S., et al. Bacterial lipoprotein TLR2 agonists broadly modulate endothelial function and coagulation pathways in vitro and in vivo. J. Immunol. 186, 1119-1130 (2011).
- Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Lucero, J., Xu, F., Hellman, J. ERK5 protein promotes, whereas MEK1 protein differentially regulates, the Toll-like receptor 2 protein-dependent activation of human endothelial cells and monocytes. J. Biol. Chem. 287, 26478-26494 (2012).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat. Rev. Immunol. 7, 803-815 (2007).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of neutrophil chemotaxis. Methods Mol. Biol. 370, 23-36 (2007).
- Garcia-Garcia, E., Uribe-Querol, E., Rosales, C. A simple and efficient method to detect nuclear factor activation in human neutrophils by flow cytometry. J. Vis. Exp. (74), e50410 (2013).
- Kuma, Y., et al. BIRB796 inhibits all p38 MAPK isoforms in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 280, 19472-19479 (2005).
- Westra, J., Kuldo, J. M., van Rijswijk, M. H., Molema, G., Limburg, P. C. Chemokine production and E-selectin expression in activated endothelial cells are inhibited by p38 MAPK (mitogen activated protein kinase) inhibitor RWJ 67657. International Immunopharmacology. 5, 1259-1269 (2005).
- Leeuwenberg, J. F., Jeunhomme, G. M., Buurman, W. A. Adhesion of polymorphonuclear cells to human endothelial cells. Adhesion-molecule-dependent, and Fc receptor-mediated adhesion-molecule-independent mechanisms. Clinical and Experimental Immunology. 81, 496-500 (1990).
- Akeson, A. L., Woods, C. W. A fluorometric assay for the quantitation of cell adherence to endothelial cells. Journal of Immunological Methods. 163, 181-185 (1993).
- Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion. Journal of Immunological Methods. 159, 93-100 (1993).
- De Clerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leucocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. Journal of Immunological Methods. 172, 115-124 (1994).
- Bevilacqua, M. P., Pober, J. S., Wheeler, M. E., Cotran, R. S., Gimbrone, M. A. Interleukin 1 acts on cultured human vascular endothelium to increase the adhesion of polymorphonuclear leukocytes, monocytes, and related leukocyte cell lines. The Journal of Clinical Investigation. 76, (1985).
- Schleimer, R. P., Rutledge, B. K. Cultured human vascular endothelial cells acquire adhesiveness for neutrophils after stimulation with interleukin 1, endotoxin, and tumor-promoting phorbol diesters. J. Immunol. 136, 649-654 (1986).
- Gamble, J. R., Harlan, J. M., Klebanoff, S. J., Vadas, M. A. Stimulation of the adherence of neutrophils to umbilical vein endothelium by human recombinant tumor necrosis factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8667-8671 (1985).
- Braut-Boucher, F., et al. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178, 41-51 (1995).
- Ait-Oufella, H., Maury, E., Lehoux, S., Guidet, B., Offenstadt, G. The endothelium: physiological functions and role in microcirculatory failure during severe sepsis. Intensive Care Medicine. 36, 1286-1298 (2010).
- Andonegui, G., et al. Endothelium-derived Toll-like receptor-4 is the key molecule in LPS-induced neutrophil sequestration into lungs. The Journal of Clinical Investigation. 111, 1011-1020 (2003).
- Sharma, J., et al. Lung endothelial cell platelet-activating factor production and inflammatory cell adherence are increased in response to cigarette smoke component exposure. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302, L47-L55 (2012).
- Deban, L., Correale, C., Vetrano, S., Malesci, A., Danese, S. Multiple pathogenic roles of microvasculature in inflammatory bowel disease: a Jack of all trades. The American Journal of Pathology. 172, 1457-1466 (2008).
- Gross, W. L., Trabandt, A., Csernok, E. Pathogenesis of Wegener's granulomatosis. Annales de Medecine Interne. 149, 280-286 (1998).
- Chen, Y., et al. Evidence of inflammatory cell involvement in brain arteriovenous malformations. Neurosurgery. 62, 1340-1349 (2008).
- Martens, C. L., et al. Peptides which bind to E-selectin and block neutrophil adhesion. J. Biol. Chem. 270, 21129-21136 (1995).
