Quantificazione della risposta Burst respiratoria come un indicatore di Innate Immune Salute in Zebrafish
Summary
La risposta immunitaria innata protegge contro l'infezione da organismi patogeni. Una componente fondamentale della risposta immunitaria innata, il burst respiratorio dei fagociti, genera specie reattive dell'ossigeno che uccidono i microrganismi invasori. Descriviamo un saggio burst respiratorio che quantifica specie reattive dell'ossigeno prodotte quando la risposta immunitaria innata è indotta chimicamente.
Abstract
Il burst respiratorio dei fagociti è parte della risposta immunitaria innata all'infezione patogeno e comporta la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS). ROS sono tossici e la funzione di uccidere i microrganismi fagocitati. In vivo quantificazione dei fagociti di derivazione ROS fornisce informazioni per quanto riguarda la capacità di un organismo di montare una risposta immunitaria innata robusto. Qui si descrive un protocollo per quantificare e confrontare i ROS in interi embrioni di zebrafish dopo induzione chimica del burst respiratorio dei fagociti. Questo metodo fa uso di un composto non fluorescente che diventa fluorescente durante l'ossidazione da ROS. I singoli embrioni di zebrafish sono aggiunti nei pozzetti di una micropiastra e incubate in questo substrato fluorogenico con o senza un induttore chimico del burst respiratorio. Fluorescenza in ogni pozzetto è quantificato in momenti desiderati utilizzando un lettore di micropiastre. Letture di fluorescenza sono rettificati per eliminare fluorescenza di fondo e poi compared utilizzando un t-test per dati non appaiati. Questo metodo permette la comparazione del potenziale burst respiratorio di zebrafish embrioni a diversi stadi di sviluppo e in risposta a manipolazioni sperimentali come proteina smontabile, sovraespressione, o trattamento con agenti farmacologici. Questo metodo può anche essere usato per monitorare la risposta burst respiratorio in interi reni sezionato o preparazioni di cellule di rene di zebrafish adulti e alcune altre specie ittiche. Crediamo che la relativa semplicità e adattabilità di questo protocollo si integrano protocolli esistenti e sarà di interesse per i ricercatori che cercano di comprendere meglio la risposta immunitaria innata.
Introduction
Il sistema immunitario è costituito da due rami: immunità innata e adattativa. L'immunità innata è evolutivamente più antica di immunità adattativa. Gli invertebrati sono attualmente pensa di avere solo l'immunità innata, mentre i vertebrati possiedono entrambi i rami innata e adattativa. Mentre l'immunità adattativa conferisce l'immunità specifica e di lunga durata a certi agenti patogeni, immunità innata è una risposta immediata ai batteri invasori, virus e funghi. Un aspetto cruciale della risposta immunitaria innata comporta il rilascio di citochine e chemochine, che si traduce in infiammazione e il reclutamento dei fagociti (es. macrofagi, neutrofili) per inghiottire e distruggere gli invasori stranieri.
Risposte immunitarie innate di successo riguardano: (1) il riconoscimento di microrganismi invasori, (2) induzione di cascate di segnalazione adeguati (ad esempio rilascio di citochine e chemochine), (3) lo sviluppo corretto / numero adeguato di fagociti; (4) La migrazione dei fagociti a siti di infezione; (5) fagocitazione di agenti patogeni, e (6) la distruzione dei microrganismi inghiottito. Una carenza in uno qualsiasi di questi passi potrebbe portare per l'host di essere sopraffatti da, e soccombere, l'infezione. Una risposta immunitaria innata robusta è vitale per la salute degli organismi perché è la prima linea di difesa contro gli agenti patogeni in tutte le piante e animali. Nei vertebrati, potenzia anche la risposta immunitaria adattativa 1. Pertanto, è fondamentale che siamo in grado di valutare tutti gli aspetti della risposta immunitaria innata per comprendere meglio e per ottimizzare la sua funzione.
Molti organismi modello sono utilizzati per studiare l'immunità innata, che vanno da Arabadopsis a C. elegans di Drosophila a topi di cellule umane in coltura. Un vantaggio di utilizzare il pesce zebra (Danio rerio) sistema modello per studiare l'immunità innata è che il zebrafish è un vertebrato, con im sia innata e adattativaComunità, ma lo sviluppo dell'immunità innata e adattativa sono temporalmente separati. Zebrafish fare affidamento esclusivamente sulle immunità innata per la protezione contro l'infezione fino a quando l'immunità adattativa diventa pienamente funzionale, che si verifica circa 4-6 settimane dopo la fecondazione 2. Oltre agli strumenti per la manipolazione genetica, chiarezza ottica e rapido, sviluppo esterno, l'immunità innata come modalità principio di difesa in embrioni di zebrafish fornisce un modello semplificato in cui studiare la complessità della risposta immunitaria innata in vivo.
Sono stati sviluppati protocolli multipli per valutare diversi aspetti della risposta immunitaria innata in embrioni di zebrafish. Microarrays e RNAseq hanno confermato che i profili delle citochine indotte dalla risposta immunitaria innata zebrafish sono simili a quello umano e hanno anche suggerito il coinvolgimento di geni inattese immunità innata 3,4. La trasparenza del zebrafish e fluorescenti, transgenderic ceppi di patogeni e zebrafish permettono la visualizzazione delle interazioni ospite-patogeno dinamici in vivo in tempo reale. Embrioni di zebrafish transgenici esprimenti GFP sotto il controllo del specifico neutrofili mieloperossidasi promotore 5,6 o la specifica-macrofago MPEG1 promotore 7 hanno permesso di visualizzare e quantificare la migrazione dei fagociti a siti di infezioni localizzate 8 nonché di visualizzare fagocitosi e distruzione di fluorescente patogeni 8,9. Embrioni di zebrafish sono anche suscettibili alla generazione di saggi high-throughput e schermi chimici. Di conseguenza, sono stati recentemente sviluppati metodi high-throughput di analisi del trascrittoma al momento dell'infezione 10 e la migrazione dei fagociti a siti di lesione indotta chimicamente 11.
Delle tecniche sopra elencate, nessuna valutare quantitativamente la fase finale di distruzione patogeno dai fagociti. Questa fase finalecomporta un burst respiratorio (ossia la produzione di ROS e di altri composti tossici), che uccidono gli agenti patogeni inghiottito. L'enzima NADPH ossidasi è una delle principali fonti di ROS in fagociti. Assemblaggio delle subunità dei NADPH ossidasi risultati degli enzimi nel trasferimento di elettroni all'ossigeno, generando anioni superossido. Attraverso successive reazioni enzimatiche, superossido può quindi essere convertito in perossido di idrogeno e acido ipocloroso (Figura 1A). È il burst respiratorio dei fagociti che uccide i patogeni e quindi, la quantificazione del potenziale burst respiratorio di embrioni di zebrafish è indicativo della salute immunitaria innata generale. Abbiamo sviluppato un saggio basato sulla fluorescenza per quantificare il burst respiratorio in gruppi di singoli embrioni di zebrafish 12. Questa analisi utilizza la non fluorescente, forma ridotta di un colorante cellula-permeabile disponibile in commercio. Questo colorante, 2 ', 7'-diclorodiidrofluoresceina diacetato (H2DCFDA), viene convertito nelle fluorescenticomposto cent, 2 ', 7'-diclorofluoresceina (DCF), in seguito all'ossidazione. Le diverse ROS generati dal burst respiratorio dei fagociti possono ossidare H2DCFDA e generare la fluorescenza 24. La comparsa di fluorescenza può essere utilizzato per quantificare e confrontare la risposta burst respiratorio tra gruppi di zebrafish. La proteina chinasi C acetato agonista forbolo miristato (PMA) viene usato per indurre chimicamente NADPH ossidasi per produrre ROS e quindi aumentare letture della fluorescenza (Figura 1B). Qui, forniamo un protocollo dettagliato di una versione modificata ed ottimizzata di questo zebrafish embrione respiratorio saggio burst. Questo test può essere utilizzato per confrontare il burst respiratorio tra gruppi di singoli embrioni di zebrafish nel tempo e / o in risposta a manipolazioni sperimentali (ad esempio morfolino-mediata knockdown proteine). L'utilizzo di questo metodo, in collaborazione con altri zebrafish saggi dell'immunità innata, fornirà un quadro più completo del complesso e criticorisposta immunitaria innata.
Protocol
Representative Results
Discussion
La funzione primaria di fagociti è quello di rilevare, inghiottire e distruggere gli agenti patogeni. La capacità dei fagociti di produrre un burst respiratorio adeguato è fondamentale per questa funzione. Pertanto, la quantificazione della risposta burst respiratorio è un metodo per permettere il confronto di salute generale e la funzione immunitaria innata tra gruppi di individui e / o in risposta a manipolazioni sperimentali. Qui, descriviamo un protocollo per indurre, quantificare e confrontare la risposta burst…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare i membri passati e presenti del laboratorio Kim, Mark Nilan per la cura e la manutenzione zebrafish, il Dr. Robert Wheeler per utili discussioni e la condivisione dei dati, e le sovvenzioni NIH 3RO1GM087308-02S1 e 1P20RR024475-01A2 e il Maine Agricole e Forestali Esperimento Stazione (Numero della pubblicazione 3303) per il finanziamento.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| H2DCFDA | Sigma Aldrich | 35845-1G | |
| PMA | Fisher | BP6851 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2438-5X10ML | |
| Tricaine S MS222 | Western Chemical | 100 grams | |
| DMEM/F-12, No Phenol Red | Life Technologies | 11039-021 | |
| Deep Petri Dishes | VWR | 89107-632 | |
| Plastic Transfer Pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| #5 Dumont Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
| 1.7 ml Micro Centrifuge Tubes | Axygen | 10011-724 | |
| 15 ml Conical Centrifuge Tubes | VWR | 21008-918 | |
| 5 ml Serological Pipettes | Greiner Bio One | 606180 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | Contact BioTek | |
| Black 96 Well Microplate | VWR | 82050-728 | |
| 25 ml Sterile Reservoirs | VistaLab | 3054-2003 | |
| P200 Pipettor | Gilson | F123601 | |
| Multichannel Pipettor | VWR | 89079-948 | |
| Pipette Tips | VWR | 89079-478 |
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