呼吸爆发的响应为先天免疫健康的斑马鱼中的指标量化

免疫系统是由两个分支：先天免疫和适应性免疫。先天性免疫是进化上比适应性免疫更古老。无脊椎动物是目前认为有只先天免疫，而脊椎动物兼具先天和适应性分支。而适应性免疫赋予具体和持久的免疫力，某些病原体，先天免疫是入侵的细菌，病毒和真菌立即作出反应。先天免疫反应的一个重要方面涉及的细胞因子和趋化因子的释放，从而导致炎症的巨噬细胞（ 如巨噬细胞，中性粒细胞）和招聘吞噬和破坏外来入侵者。

成功的先天免疫反应包括：（1）识别入侵微生物的;（2）感应相应的信号级联反应（ 如释放细胞因子和趋化因子）的;吞噬细胞（3）适当发展/数量充足;（4）吞噬细胞对感染部位迁移;（5）吞噬病原体;和（6）破坏吞噬微生物。在这些步骤中的任何一个A缺乏可能导致被淹没由主机，并屈服于，感染。一个强大的先天免疫反应是生物体的健康是至关重要的，因为它是抵御病原体的所有植物和动物的第一道防线。在脊椎动物中，它也可加强适应性免疫应答^1。因此，我们能够评估，以便更好地理解它，并优化它的功能的先天免疫反应的所有方面它是至关重要的。

许多模式生物用于研究先天免疫，从Arabadopsis为C。线虫到果蝇到小鼠培养的人类细胞。使用斑马鱼（ 斑马鱼 ）的模型系统来研究先天免疫系统的优点在于，斑马鱼是脊椎动物，既有先天和适应性即时通讯群落，但先天免疫和适应性免疫的发展在时间上分开。斑马鱼仅仅依靠先天免疫保护，防止感染，直到适应性免疫成为功能齐全，它发生在大约4-6周后受精^2。除了 ​​遗传操纵，光学透明性和快速，外部开发工具，先天免疫防御如在斑马鱼胚胎的原理模式提供了在其中以研究在体内的先天免疫反应的复杂性的简化模型。

多个协议已被开发，以评估在斑马鱼胚胎的先天免疫反应的不同方面。微阵列和RNAseq已经证实，通过斑马鱼先天免疫反应引起的细胞因子谱是相似于人类和也建议意想不到基因在先天免疫^3,4的参与。斑马鱼胚胎和荧光灯，transgen的透明度病原体和斑马鱼集成电路菌株允许动态宿主-病原体相互作用的体内实时可视化。转基因斑马鱼胚胎中表达绿色荧光蛋白在中性粒细胞特异性髓过氧化物酶启动子^5,6或巨噬细胞特异性启动子的mpeg1 ⁷的控制使人们有可能以可视化和量化吞噬细胞迁移到局部感染⁸的网站以及可视化吞噬和破坏荧光标记的病原体^8,9。斑马鱼的胚胎也适合进行高通量测定法和化学画面的生成。因此，最近已经开发了感染¹⁰和巨噬细胞迁移到化学诱导损伤¹¹的位点后转录组分析的高通量方法。

上面列出的技术中，没有定量评估吞噬细胞破坏病原体的最后阶段。此最后阶段涉及呼吸爆发（ 即产生的活性氧和其他有毒化合物），其中杀死吞噬病原体。酶的NADPH氧化酶是ROS在吞噬细胞的主要来源。组件的NADPH氧化酶产生的电子转移到氧亚基中，产生超氧阴离子。通过随后的酶促反应，超氧化物可以被转化成过氧化氢 ​​和次氯酸（ 图1A）。它是呼吸爆发吞噬细胞，杀死病原体，因此，斑马鱼胚胎的呼吸爆发潜力的量化指标是总体先天免疫的健康。我们开发了一种基于荧光的测定法来量化在个别斑马鱼胚胎的¹²个组的呼吸爆发。这个测定法利用市售的，细胞渗透性染料的非荧光，还原形式。这种染料，2'，7'-二氯二乙酸酯（H2DCFDA），被转换成荧光％的化合物，2'，7'-二氯荧光（DCF），在氧化时。由吞噬细胞呼吸爆发产生的活性氧多样可H2DCFDA氧化并产生荧光^24。荧光的外观可以被用来量化和比较斑马鱼的组之间的呼吸爆发的反应。蛋白激酶C激动剂佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯（PMA），用于化学诱导NADPH氧化酶产生活性氧，从而提高荧光读数（ 图1B）。在此，我们提供的这个斑马鱼胚胎呼吸爆发检测的修改和优化版本的详细协议。此测定法可用于比较在一段时间和/或响应于实验操作（ 例如，吗啉代-介导的蛋白敲低）个别斑马鱼胚胎的基团之间的呼吸爆发。使用这种方法时，在与其他斑马鱼先天免疫测定法结合使用，将提供复杂和关键的更完整的图象先天免疫应答。