フライトのマトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間（MALDI-TOF）100kDaのより大きなインタクトタンパク質の質量分析

1。タンパク質サンプル調整：バッファー交換（オプション） タンパク質のマイクロモル濃度（1から20μm）で5月25日μLが必要です。緩衝液交換は、29,30、遠心限外濾過装置（ 例えばビバスピン、ザルトリウス）または微量遠心ゲル濾過カラム（ 例えば 、マイクロバイオスピン6クロマトグラフィーカラム、Bio-Rad）を用いて行うことができる。バッファー交換ステップは、2〜3倍を繰り返すことができる。緩衝液交換の詳細な説明は、以前に29,30を発表した。例えば、我々は最終的な緩衝液として20mMのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ すなわちトリス）は、pH 8を利用する。 注：このステップは、多くの場合、省略することができる。タンパク質試料を強くMS検出に干渉する可能性分子または緩衝剤が含まれている場合には、行われるべきである[ 例えばグリセロールと、4 – （2 -ヒドロキシエチル）-1 -ピペラジンエタンスルホン酸、HEPES]。それは、QUを向上させるためにも便利ですスペクトルのality。 2。それらの純度（オプション）を改善するために、行列の再結晶パイレックスフラスコに40％エタノール（EtOH）10ml中に注ぐ。 行列の600ミリグラムを追加します。 水浴と抵抗ヒーターを用いて、マトリックス溶液を加温し、マトリックスが完全にガラス棒または磁気スターラーを用いて溶解するまで攪拌する。 あなたは飽和溶液になるまで、手順2を繰り返します。 注意：溶剤をあまりに大量に使用したり、遠く溶液の沸点以下のマトリックスを溶解させて結晶又は全く結晶の歩留まりが悪いの原因となります。 溶液をゆっくりと冷却します。あなたは、数時間室温のままにし、次いで4℃で一晩できる。注：結晶が形成されていない場合は、結晶化ガラス攪拌棒を使用して、（ちょうど液面下）ビーカー内を引っ掻くことによって誘導することができる。 濾過によりマトリックス結晶を収集します。 氷のように冷たい溶媒の最小限の結晶を洗浄し、それらをろ過する。 結晶を乾燥させる。このステップのために真空を使用することができます。 3。 MALDIステンレス鋼ターゲットのクリーニングメタノール（MeOH）でMALDIプレートをすすぎ、特別に研究室のアプリケーション（ 例えばキムワイプ）のために作らクリーニングティッシュでやさしく拭きます。 H 2 Oでターゲットをすすぎ、クリーニングティッシュで拭いてください。 600ミリリットルのビーカーにMALDIプレートを挿入し、50％エタノールでそれをカバーしています。 超音波浴中で10分間EtOH溶液中の標的に超音波処理する。 プレート上に残った残留物がある場合は、もう一度1から4の手順を繰り返します。 最後に、すべての液体がクリーニングティッシュ上で収集された方法でそれを傾け、（または水で、下の注を参照）、MeOHでターゲットをすすぐ。室温での目標を乾燥させるか、使用して窒素、ガス流。 注：同様の手順は、以前に15を説明した。 注意：ターゲットの最後のすすぎのために使用される溶媒（メタノールまたは水）は、いくつかのターゲットの特徴を決定します。標的をMeOHでリンスすると、サンプルは、水を使用した場合よりもはるかにターゲット上に広がる。 4。 α-CHCA薄層溶液：MALDIターゲット上の準備と堆積飽和溶液を作るためにアセトン中でα-CHCAを溶解する。 手で（任意のピペットせずに）、α-CHCA飽和溶液中に10μlの先端（ 例えば GELoaderヒント、エッペンドルフ）を浸します。ソリューションを少量（毛細管現象により）先端に流れます。 ピペットチップで非常に急速に（ つまり 1秒）、MALDIターゲットをタッチし、MALDIターゲット上のα-CHCAアセトン溶液を堆積させる。これは、マトリックスの薄層に、タンパク質を構成するサンプルが堆積される。可能な限り小さく薄層スポットを生成しよう。 注意：マトリクスとしてのSAを使用する場合、我々はアセトン中のSAの飽和溶液を用いた薄層を作製。 5。ユウダ属溶液の調製：SA、α-CHCA、DHBとCHCA_DHB混合25 ACN中の20 mg / mlのSA溶液を調製し、0.1％TFA（70:30、体積/体積）。 20のACN mg / mlのα-CHCA溶液及び5％ギ酸[「α-CHCA溶液」という名前]（70:30、体積/体積）を準備します。 ACN中20 mg / mlのDHB溶液と、["DHB液」と名付け] 0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）（70:30、体積/体積）を準備します。 「CHCA_DHB溶液」を得るために、1:1の比（体積/体積）の「α-CHCA溶液」及び「DHB溶液を「混合する。 注：質量100kDa未満を有するタンパク質を分析する際に一つは、異なる比率で「α-CHCA溶液」と「DHBソリューション」を混在させることができます。 EXA用mpleα-CHCAとDHB（vol / vol）の間の40:60の比率がより高い分解能が、あまり感度が（議論を参照）が得られる。 6。 MALDI標的上のサンプル堆積先に調製したα-CHCA薄層上にタンパク質試料の寄託0.5μL。その直後に、マトリックス溶液（ すなわち 、SA液やα-CHCA溶液または「CHCA_DHBミックス」）の0.5μlを添加する。これは、ターゲット上に試料とマトリックスとを混合することを意味。 注意：通常、一方が1:1の比率でマトリクスとタンパク質サンプルを混合する。この比率は、MALDIスペクトルの良質のために重要である。あなたは、異なるサンプル濃度をテストしたい場合は、サンプルを希釈する（前述）ACN_formic酸溶液を使用することができます。 注：必要に応じて、あなたは、チューブ内の試料とマトリックスを混合し、次いで混合」sample_matrixソリューションを堆積させることができます薄層上のTiON」。 注意：試料を希釈するとあなたは汚染物質の干渉を低減することを可能にするため、我々は、異なるサンプル濃度をテストすることをお勧めします。試料を希釈するためには、サンプルを希釈する（前述）ACN_formic酸溶液を使用することができます。 7。キャリ堆積預金キャリ基準の0.5μL（ 例えば 「タンパク質標準II」、ブルカーダルト、ブレーメン）をマトリックス溶液0.5μlを加える。 注：（説明を参照）タンパク質試料スポットの隣にMALDIプレート上で較正をロードします。 8。キャリブラントのMALDIスペクトル取得とタンパク質サンプルサンプルおよびキャリブラントが乾燥したら、顕微鏡下で「スポット」を観察することができます。この観察結果は、オプションであり、主に初心者に興味深いものになることがあります。サンプルスペクトルを取得するために、目を挿入EのMALDI-TOF装置におけるターゲットや機器の種類ごとに異なっており、適切な機器パラメータを選択します。最も適切なセットアップを取得するには1を、製造業者の推奨に従ってください。インタクトタンパク質を分析する際の一般的な考慮事項として、1は（分析し、ペプチドに適していない、反射モードでは、）リニアモードで測定器を使用する必要があります。通常、我々は、正イオンモードで私たちの楽器を使用しています。また、キーパラメータは、楽器の分解能31を改善し「パルスイオン抽出」である。簡単に言えば、「パルスイオン抽出」とは、試料イオンの生成イオンが検出器に向かって加速される時間との間の休止として定義することができる。インタクトタンパク質を分析する場合、1ペプチドを観察するときよりも大きな「パルスイオン引き出し」（ 例えば 500ナノ秒）を利用しなければならない（ 例えば 80ナノ秒）。 適切なm / z範囲を選択して、スペクトルOを取得キャリ女、機器を校正。あなたのサンプルのスペクトルを取得した場合、（説明を参照）、適切なレーザー強度を使用しています。